人源食管鳞状细胞癌移植瘤模型的建立及其增殖信号通路特征*

金玉茜， 李 珂， 尹学善， 谢祎飞， 王艳红， 赵四敏, 4， 江亚南, 2， 赵继敏, 2，赵 松， 田 芳, 2， 路 静, 2， 刘康栋, 2△， 董子明, 2△

(1郑州大学基础医学院，河南 郑州 450001； 2河南省癌症化学预防协同创新中心，河南 郑州 450000；3郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052； 4漯河高等医学专科学校，河南 漯河 462000)

人源食管鳞状细胞癌移植瘤模型的建立及其增殖信号通路特征*

金玉茜1▲， 李 珂1▲， 尹学善1， 谢祎飞1， 王艳红1， 赵四敏1, 4， 江亚南1, 2， 赵继敏1, 2，赵 松3， 田 芳1, 2， 路 静1, 2， 刘康栋1, 2△， 董子明1, 2△

(1郑州大学基础医学院，河南 郑州 450001；2河南省癌症化学预防协同创新中心，河南 郑州 450000；3郑州大学第一附属医院胸外科，河南 郑州 450052；4漯河高等医学专科学校，河南 漯河 462000)

目的： 构建人食管鳞状细胞癌组织来源的移植瘤模型，并了解其病理学特征和增殖相关的信号通路活化情况。方法: 将人食管癌组织移植于重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下，待移植瘤长成后对其进行鼠间连续传代。观察第1、第2、第3代移植瘤的生长特性。并对患者肿瘤组织、第1代和第3代移植瘤进行HE染色和CK5/6、p63、p40免疫组织化学染色分析。Western blot实验检测4例所建立的移植瘤中mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、Akt1、p-Akt (Ser473)、Erk1/2和p-Erk1/2的表达情况。结果: 成功建立移植瘤模型，移植瘤生长稳定并能连续传代。各移植瘤组织病理组织类型和CK5/6、p63、p40表达阳性与患者肿瘤组织一致。而在不同病人来源的移植瘤组织中信号转导通路蛋白的活化程度差异有统计学意义。结论: 成功建立了人食管鳞状细胞癌组织来源的食管癌移植瘤模型，初步论证该模型能够反映患者的病理特征。

食管癌； 人源移植瘤； 增殖相关信号通路

食管癌是世界上最常见的 6 种恶性肿瘤之一，尤其是在中国，食管癌的发病率和死亡率都居于世界上最高的国家之一，严重威胁人民生命健康。我国食管癌的主要病理类型是食管鳞状细胞癌(eso-phageal squamous-cell carcinoma，ESCC)[1]，其侵袭性强并缺乏有效的治疗策略，晚期具有极高的死亡率[2]，5年存活率只有20～40%。转移性食管癌的患者在使用化疗和药物治疗的情况下平均存活期不足 1 年[2]。

在抗癌药物和治疗方案的临床研究中，动物模型发挥了重要的作用，合适的动物模型将会促进药物的研发和有效的治疗方案的制定[3]。研究发现，人肿瘤细胞系的异体移植模型预测性较差，在肿瘤靶向药物的研究中存在一定的局限性[4]。主要原因是建立的细胞系不能充分代表肿瘤的多样性和个体化，并且细胞系在多次体外处理和传代后，其组织学特征和遗传学特征会发生改变[4]。直接将患者的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠而建立的人源性肿瘤模型则可以克服上述缺点[5-6]，可以模拟肿瘤患者对化疗方案的反应。因此，建立与临床ESCC特征相似的人源性肿瘤模型对于进一步了解食管癌的发生机制和筛选分子靶标及评价个体化靶向治疗的疗效具有重要意义。目前国内外已报道人源性肿瘤动物移植瘤模型在肺癌、乳腺癌和结肠癌等研究领域发挥重要作用，得到的移植瘤模型与临床肿瘤的特征相似，而对食管鳞状细胞癌移植瘤模型却报道较少，缺乏对其的深入研究和系统评价[7]。

在本研究中，我们在重度联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠皮下移植人食管鳞状细胞癌组织，建立了多例能传代并能保持人食管癌临床组织特征的人源食管鳞状细胞癌移植瘤模型(patient-derived esophageal squamous-cell carcinoma xenograft，PDECX),并对这些模型的病理特征进行评价，检测其肿瘤信号转导通路激酶的激活情况，为食管癌临床筛选新的靶向药物和评价个体化靶向治疗方案的疗效提供依据。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 病理组织标本 病理标本取自从2013年8月～2014年3月郑州大学第一附属医院的食管癌外科手术中ESCC患者的肿瘤组织。患者术前均未接受过放疗和化疗。ESCC样本均在患者签署郑州大学研究伦理委员会批准的书面知情同意和研究协议后获取。手术新鲜组织标本被分为3个部分：(1) 植入SCID小鼠体内进行模型构建; (2)4%甲醛固定，制作石蜡以病理检查及免疫组织化学分析; (3) -80 ℃冻存，用于DNA / RNA的提取。

1.2 实验动物 实验研究使用平均体重18～20 g的6～8周雌性CB17/SCID小鼠，均购自北京维通利华动物实验有限公司(动物合格证编号：11400700067581)。动物房配备可调控空调和灯光(12 h周期)以使小鼠在恒温恒湿的环境下生长。一个无菌笼中饲养4～5只小鼠并提供充足的水和食物。笼具、垫料、饲料、饮水均经高压蒸汽灭菌。所有实验程序均严格按无菌操作规程进行。

2 方法

2.1 人食管癌组织来源的移植瘤模型的构建 ESCC病理标本在切除后90 min内在无血清RPMI-1640培养基中运送到实验室。标本用含有青霉素和链霉素的PBS冲洗。用无菌手术刀切成3个或4个小块用于移植(每块大小约10～15 mm3)。事先用0.3 mL 0.4%戊巴比妥钠溶液将小鼠麻醉，待其进入麻醉状态后将每块肿瘤组织于颈背部以皮下植入的方式移植到SCID小鼠上，1只小鼠接种1块肿瘤。移植之后，每周测量1次小鼠体重和肿瘤的大小。当肿瘤体积达到1 500 mm3后，将小鼠处死，于75%乙醇中浸泡，解剖并剥离该肿瘤(此为患者的第1代肿瘤组织)，给其拍照和称重，再将此肿瘤切成3个或4个小块(同前)移植到新1代的SCID鼠上(此为第2代移植瘤)。当移植瘤被稳定传代至3代或3代以上时则认为PDECX成功建立。

2.2 肿瘤生长的测量 移植瘤的大小用游标卡尺每周测量1次。肿瘤体积的计算使用公式V = LD×SD2/2，其中V是肿瘤体积，LD是肿瘤的最长直径，SD是肿瘤的最短直径。测量的肿瘤体积数据用于描绘肿瘤生长曲线。

2.3 病理组织学评估和免疫组织化学鉴定 所有构建成功的PDECX肿瘤组织离体后立刻被置于4%甲醛中固定24 h，随后转移至70%乙醇进行脱水处理，再用石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，通过HE染色进行病理学评价，同一连续切片用枸橼酸钠修复液进行抗原修复，再用鼠抗人CK5/6、p63和p40(1∶50)单抗4 ℃孵育过夜，第2天孵育 II抗(鼠IgG2a)，检测组织中CK5/6、p63和p40的表达。所有结果均使用Olympus显微镜观察。

2.4 Western blot实验 液氮研磨移植瘤组织，用裂解液使组织裂解得到组织总蛋白，12 000 r/min离心组织蛋白15 min。取总蛋白50 μg于10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并转移至聚乙烯二氟(PVDF)膜。随后用含5%脱脂牛奶的1×TBST室温封闭膜1 h，将膜置于I 抗稀释溶液中4 ℃孵育过夜(anti-mTOR、anti-p-mTOR、anti-p70S6K、anti-p-p70S6K、anti-Akt1、anti-p-Akt (Ser473)、anti-Erk1/2和anti-p-Erk1/2的稀释度均为1∶1 000)。II抗HRP-IgG在室温下作用2 h，加ECL显影。用曝光系统扫描膜，并用ImageJ软件进行蛋白质条带灰度的定量分析。

3 统计学处理

用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，组间比较采用单因素方差分析，用方差齐性检验结果来表示组间差异，以P<0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 人组织源性食管鳞状细胞癌移植瘤模型的建立

我们进行了15例ESCC病理组织的接种和传代，其中成功建立移植瘤模型并稳定传代共8例，成功率53.33%。成功建立移植瘤模型的小鼠如图1所示。成功建立的移植瘤模型均可以稳定传代，其第1代(P1)和第2代(P2)移植瘤生长较缓慢，自第3代(P3)及以后移植瘤生长速度较快并稳定。其中病例1号移植瘤肿瘤体积生长曲线如图2所示，P1、P2和P3的生长时间分别为91 d、91 d和62 d。

2 PDECX模型与患者原始肿瘤的病理特征和免疫组织化学的鉴定比较

通过HE染色和免疫组织化学方法比较患者病理组织与移植瘤组织的病理特征、鳞状细胞癌标志蛋白的表达情况，其中2号病例移植瘤与原患者肿瘤组织对比结果如图3所示。HE染色显示患者肿瘤组织(P0)中有不同程度的角化珠出现，细胞间可见细胞间桥，而P1和P3代移植瘤组织与患者肿瘤组织的病理分化程度基本一致。CK5/6、p40和p63染色结果提示各项指标在P0、P1和P3肿瘤组织中均呈现出阳性表达，结果具有一致性。

3 Western blot检测移植瘤信号转导通路相关蛋白

用Western blot实验检测移植瘤组织中的主要肿瘤信号转导通路的激活情况，包括mTOR、Akt、p70S6K和Erk1/2的蛋白总量和磷酸化水平，其结果如图4所示。每一例移植瘤组织的各种信号转导通路蛋白激活情况并不相同，磷酸化的mTOR蛋白在4、6号病例移植瘤中的水平较高，而在3、5号病例移植瘤中几乎测不出；磷酸化的p70S6K蛋白在6号病例移植瘤中几乎测不出，而在其余3例中有不同程度的检出；磷酸化的Akt (Ser473)在4号病例移植瘤中水平较高，在6号病例移植瘤中水平很低；磷酸化的Erk1/2蛋白在这4例移植瘤组织中均存在，但其含量各有不同。经方差分析显示，各例移植瘤磷酸化mTOR、P70S6K、Akt和Erk1/2均有显著差异(P<0.01)。每一例移植瘤取3个组织块检测以上信号通路蛋白水平，共检测3次，取3次平均值作图。

Figure 1.A tumor-bearing mouse of a successful ESCC xenograft.

图1 成功建立ESCC移植瘤模型的荷瘤小鼠

Figure 2.Growth curves of the ESCC xenografts in the SCID mice.

图2 SCID小鼠体内ESCC移植瘤的肿瘤体积生长曲线

Figure 3.The histological images of the original patient’s tumors and the first passage and third passage xenografts from sample No.2. The top row images showed histological sections (HE) of the esophageal patient tissue (P0), the first (P1) and the third passage (P3) xenograft tissues in the SCID mice. The second, third and last row of images showed immunohistochemistry for CK5/6, p40 and p63 in the esophageal patient tissue (P0), and the first (P1) and third passage (P3) xenograft tissues, respectively.

图3 2号病例患者原始肿瘤组织与第1代和第3代移植瘤的组织学比较结果

讨 论

食管癌一种具有高死亡率的癌症,其发生发展是多基因参与、多途径、多阶段发展演进模式[8]。目前食管鳞状细胞癌治疗的基本方法仍然是手术。使用放化疗联合的治疗方法及新辅助化疗虽然在临床试验中得到了进展，但治疗效果仍然有限[9-10]。此外，使用西妥昔单抗与放化疗结合的治疗方法在IB/II期的临床试验中取得进展[11]，但在之后IIB/III期的临床试验中却没有成功[12]。而其它食管鳞状细胞癌的新治疗药物的疗效仍处于研究过程中[13-14]。因此，目前临床上对于食管鳞状细胞癌的治疗依然没有好的靶向治疗方案。

食管癌细胞系的异体移植模型在药物筛选和机制研究上有所应用[15-16]，但这些细胞系有着因长时间的体外培养而失去原始肿瘤特征的问题。此外，大多数食管癌细胞系是食管腺癌来源，这与中国患者以ESCC的病理特征为主的情况不相符。人源性移植瘤模型是直接将新鲜人肿瘤组织接种到免疫缺陷小鼠中而建立起来的，这与传统人癌细胞系建立的肿瘤动物模型相比，可以更好地保持人肿瘤组织的原始生物学特征和组织学特征，可以反映患者的遗传多样性[17]。因此，建立临床相关的ESCC动物异种移植肿瘤模型是及其必要的。本研究建立的是一组中国病人来源的ESCC异种移植小鼠模型，为筛选临床新药物和选择有效的临床治疗方法提供临床前平台。

Figure 4.Activated mTOR, Akt, p70S6K and Erk1/2 in the established esophageal tumor xenografts determined by Western blot. Mean±SD.n=3.

图4 已建立食管癌移植瘤组织的信号通路磷酸化表达情况，包括mTOR、Akt、p70S6K和Erk1/2

在本实验中，成功建立了移植瘤模型，并且移植瘤生长情况在第3代及以后保持稳定，这与国内外其它研究中肺癌和乳腺癌等移植瘤模型的生长情况一致[18]。在免疫组织化学鉴定中，本实验检测了CK5/6、p40和p63蛋白的表达情况。CK5/6被用于从肺癌中区分上皮样的间皮癌。p40由p63基因编码翻译，选择性强，因此其诊断的特异性好。p63蛋白在ESCC的发生发展中发挥重要作用，其通过Akt蛋白激酶信号通路控制细胞周期以使食管鳞状细胞癌细胞增殖[19]。临床上检测p63的表达水平用于ESCC的确诊以及预后评估[20]。在我们的实验中，根据组织学和免疫组化鉴定中各个移植瘤组织切片的CK5/6、p40和p63染色结果显示P3肿瘤组织与患者原代肿瘤组织的染色情况即表达水平均为基本一致，这表明了ESCC移植瘤模型保留了与其原代即人肿瘤组织一致的组织病理学特征。因此可证明，我们使用最小限度的患者肿瘤组织成功地建立了ESCC的异种移植肿瘤模型。

ESCC的化疗有许多副作用，需要更多创新和有效的治疗策略。然而，ESCC肿瘤发生的分子机制还没有被完全阐明。许多信号通路参与ESCC的细胞生长、凋亡以及血管的生成和侵袭[21-22]，例如Akt/mTOR、Erk1/2信号通路。现已发现Akt在食管肿瘤中具有比在相应的正常组织中更强的持续活性。mTOR信号通路对于ESCC的增殖和转移至关重要[23]，因此Akt/mTOR信号通路可能是一个治疗食管癌患者的有效治疗靶向。检测移植瘤模型中信号转导通路的磷酸化情况则可以反映出ESCC患者肿瘤组织信号转导通路的活化情况，为将来患者是否能够采取靶向治疗及预测疗效建立实验平台。因此，本研究检测了4例移植瘤组织中细胞转导通路蛋白mTOR、Akt、p70S6K和Erk1/2的表达和磷酸化情况。本实验中Akt和p-Akt、mTOR和p-mTOR检测结果显示，病例4号移植瘤组织中p-mTOR和p-Akt的表达水平均高于其它3例，因此我们可以从各例肿瘤组织中挑择出Akt/mTOR通路蛋白高磷酸化水平的肿瘤组织，以用于进一步研究ESCC中Akt/mTOR通路作用和评价该通路抑制剂的效果。在PI3K/Akt/mTOR信号通路中，活化的mTOR通过磷酸化蛋白翻译过程中的某些因子来参与多项细胞功能，其中最主要的是4EBP1和p70S6K。在这4例移植瘤中，p70S6K的磷酸化水平均有不同，在病例6号移植瘤中几乎不表达。细胞外信号调节激酶Erk1/2信号通路是调控细胞生长的重要通路[24]。Erk1/2的磷酸化可通过针对不同的调节因子控制转录以诱导增殖、分化和防止细胞凋亡[25]。我们的结果显示这4例肿瘤中p-Erk1/2在病例5号和病例6号中几乎不表达，而在病例4号肿瘤中却表达很高。因此，像原始患者肿瘤组织一样，PDECX中各移植瘤瘤组织虽然有着相同或者相似的病理特征，却存在着不同信号转导通路的激活，这可以从一定程度上解释临床食管癌患者为何对一线化疗方案反应敏感性不同，进而为临床筛选新的靶向药物和评价个体化靶向治疗疗效提供平台。

综上所述，人源性移植瘤模型的建立模拟了临床人食管鳞状细胞癌的病理特征，是一种较为理想的人肿瘤动物模型[17, 26]。在本研究中，我们成功地建立了多例中国患者来源的ESCC移植瘤模型，所建立的肿瘤模型能稳定传代并保持患者肿瘤组织的病理特征。同时，ESCC肿瘤中信号转导通路不同的激活情况也反映了患者群体中的个体差异性。因此这些移植瘤模型为研究ESCC的分子机制以及阐明食管癌肿瘤发生和发展的关键信号通路提供了一个重要的平台，而且移植瘤模型还可用于筛选人食管癌靶向药物和评价临床食管癌治疗方案的合理性，为临床进一步开展患者个体化治疗提供了临床前平台。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Establishment of patient-derived esophageal squamous-cell carcinoma xenograft in mice and characteristics of signaling pathways related to proliferation in SCID mice

JIN Yu-xi1, LI Ke1, YIN Xue-shan1, XIE Yi-fei1, WANG Yan-hong1, ZHAO Si-min1, 4, JIANG Ya-nan1, 2, ZHAO Ji-min1, 2, ZHAO Song3, TIAN Fang1,2, LU Jing1, 2, LIU Kang-dong1, 2, DONG Zi-ming1, 2

(1SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China;2HenanProvincialCooperativeInnovationCenterforCancerChemoprevention,Zhengzhou450000,China;3DepartmentofThoracicSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China;4LuoheMedicalCollege,Luohe462000,China.E-mail:kdliu@zzu.edu.cn；dongzm@zzu.edu.cn)

AIM: To establish and characterize the patient-derived esophageal squamous-cell carcinoma xenograft (PDECX) in mice. METHODS: The samples of human esophageal cancer were grafted into severe combined immunodeficient (SCID) mice. The xenografts were transferred to SCID mice when the first passage of xenografts grew up. The growth of tumors in the first, second and third passages was observed. HE staining was performed. The expression of CK5/6, p63 and p40 in the patient samples, and the first and third passages of the xenografts were detected by immunohistochemical analysis. The expression of mTOR, p-mTOR, p70S6K, p-p70S6K, Akt1, p-Akt (Ser473), Erk1/2 and p-Erk1/2 were determined by Western blot.RESULTS: The PDECX was successfully established. The positive expression of CK5/6, p63 and p40 in the xenografts was consistent with that in the patients’ samples. The levels of phosphorylated and total proteins of proliferation-related signaling pathways were different in the xenografts from different patients.CONCLUSION: The PDECX model adequately reflects the tumal heterogeneity that is observed in the patients.

Esophageal carcinoma; Patient-derived tumor xenograft; Proliferation-related signaling pathway

1000- 4718(2016)08- 1450- 07

2015- 11- 16

2016- 04- 07

国家自然科学基金资助项目(No. 81372269； No. 81572812)；河南省高校创新人才项目(No. 13HASTIT022)；国家级大学生创新创业训练计划(No. 201410459075)

R730.23; R735.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.019

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 刘康栋 Tel: 15036033760; E-mail: kdliu@zzu.edu.cn； 董子明 Tel: 13903811199; E-mail: dongzm@zzu.edu.cn

▲并列第1作者