CCR7和VEGF-C蛋白与乳腺癌预后之间的关系*

刘清华， 于国华， 刘雨清

(潍坊医学院 1人体解剖学教研室， 2病理学教研室，山东 潍坊 261053； 3潍坊市人民医院肿瘤内科，山东 潍坊 261041)

CCR7和VEGF-C蛋白与乳腺癌预后之间的关系*

刘清华1， 于国华3， 刘雨清2

(潍坊医学院1人体解剖学教研室，2病理学教研室，山东 潍坊 261053；3潍坊市人民医院肿瘤内科，山东 潍坊 261041)

目的： 探讨趋化因子受体7(CCR7)及血管内皮生长因子C(VEGF-C)蛋白在乳腺癌组织中的表达水平，并分析二者与乳腺癌预后的关系。方法: 采用免疫组织化学技术，联合检测CCR7和VEGF-C蛋白分别在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达差异情况，并分析二者与乳腺癌各相关临床病理特征之间的关系。采用Kaplan-Meier法来评估CCR7及VEGF-C蛋白的异常表达与乳腺癌患者生存期之间的关系。结果: CCR7蛋白在乳腺癌组织(68%)中的阳性表达率高于正常乳腺组织(30%)，差异有统计学显著性(P<0．01)；而VEGF-C蛋白在乳腺癌组织(71%)中的阳性表达率也明显高于正常乳腺组织(24%)，差异也有统计学显著性(P<0．01)。且在乳腺癌组织中，CCR7与VEGF-C蛋白的表达呈正相关关系(r=0.613，P<0．01)。CCR7和VEGF-C蛋白的高表达均与淋巴结转移和TNM分期有关(P<0．05)，而与年龄、肿瘤大小、雌激素受体和孕激素受体均无关。CCR7及VEGF-C蛋白阳性表达者的生存期低于阴性表达者，两组比较差异有统计学显著性(P<0．05)。结论: CCR7与VEGF-C的异常高表达可能与乳腺癌预后关系密切，二者可作为判断乳腺癌预后不良的重要指标之一。

趋化因子受体7； 血管内皮生长因子C； 乳腺癌

目前，乳腺癌的发病率已跃居女性恶性肿瘤的首位[1]，且有无淋巴结转移是影响患者预后的重要决定性因素之一。基因定位于17q12～q21.2区域的趋化因子受体7(chemokine receptor 7，CCR7)与其它趋化因子一样，是一种G-蛋白偶联的7次跨膜受体。有研究发现，CCR7与多种肿瘤细胞的侵袭、转移关系密切[2]。血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)作为新发现的生长因子家族成员之一，可与酪氨酸激酶受体VEGFR-3结合，从而促进肿瘤淋巴管及血管的生成，参与肿瘤的侵袭、转移[3]。目前，CCR7和VEGF-C是否在乳腺癌组织的转移中起协同作用，尚不完全清楚。但已有研究表明，有效控制影响恶性肿瘤细胞侵袭、转移的相关因素，对提高临床治疗和改善患者的预后有重要意义。因此，本研究采用免疫组织化学Max VisionTM二步法，分别检测CCR7和VEGF-C蛋白在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达水平，并进一步分析二者与乳腺癌各相关临床病理特征之间的关系，从而为乳腺癌的分子靶向治疗及预后评估等提供新的靶点和理论依据。

材 料 和 方 法

1 一般资料

选取2009年1月～2015年12月在潍坊市人民医院肿瘤科行手术治疗的乳腺癌患者85例，其中伴有淋巴结转移者52例，不伴淋巴结转移者33例。术后乳腺癌标本均做石蜡包埋。乳腺癌手术切除标本按照AJCC乳腺癌临床分期(2003)标准分类，TNMⅠ期20例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例，Ⅳ期23例。所有患者术前均未接受任何化疗和抗肿瘤治疗，术后常规病理诊断(HE染色)确诊为乳腺癌。且术后均在肿瘤科接受化疗，随访资料完整。患者生存期从手术之日开始计算, 终止日期为肿瘤复发日期或末次随访日。截止日期为2015年12月30 日，随访期限为6～84个月不等。发病年龄为28～80岁，平均年龄(54.0±10.7)岁。同时，取乳腺癌5 cm以外的正常乳腺组织50例作为阴性对照。

2 试剂与方法

兔抗人CCR7多克隆抗体、兔抗人VEGF-C多克隆抗体、通用型二步法免疫组化检测PV-9000试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司；PBS缓冲液、DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。所有实验组织均经10%甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，以5 μm厚连续切片。免疫组化技术采取Max VisionTM两步法，具体操作严格按试剂盒说明书进行。以PBS液代替 I 抗作为阴性对照。

3 结果判定

采用双盲法，分别对CCR7和VEGF-C蛋白染色结果进行评判。CCR7和VEGF-C蛋白阳性表达均定位于细胞膜和(或)细胞质，背景清晰，染成淡黄色、棕黄色或棕褐色。根据阳性细胞染色强度和阳性细胞计数进行综合评分。染色强度分类为：无着色计0分，淡黄色计1分，黄或棕黄色计2分，褐或棕褐色计3分。对阳性细胞进行计数：根据阳性细胞所占5个以上高倍镜视野比例计数，0分为阳性细胞<5%，1分为5%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为≥76%。二者积分相乘，0～4分为(-)，5～12分为(+)，≥4分者为高表达，<4分为低表达。

4 统计学处理

结 果

1 CCR7和VEGF-C蛋白在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达

CCR7蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率(68%)高于正常乳腺组织(30%)，两组比较差异有统计学显著性(P<0.01)。VEGF-C蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率(71%)也高于正常乳腺组织(24%)，两组比较差异也有统计学显著性(P<0.01)，见图1、2及表1。

2 CCR7和VEGF-C蛋白在乳腺癌中表达的相关性

经Spearman等级分析结果表明，在乳腺癌组织中CCR7和VEGF-C蛋白的表达呈正相关关系(r=0.613，P<0.01)。

3 乳腺癌组织中CCR7和VEGF-C的表达与临床病理特征之间的关系

CCR7和VEGF-C异常高表达均与乳腺癌淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)，而与年龄、肿瘤大小、雌激素受体(estrogen receptor，ER)和孕激素受体(progesterone receptor，PR)均无关，见表2。

Figure 1.The protein expression of CCR7 in normal breast tissue (A, ×100) and breast cancer tissue (B, ×400).

图1 CCR7在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达

Figure 2.The protein expression of VEGF-C in normal breast tissue (A,×100) and breast cancer tissue (B,×400).

图2 VEGF-C在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达

表1 CCR7和VEGF-C在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达

表2 CCR7和VEGF-C在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系

Table 2.The relationship between the expression of CCR7 and VEGF-C and clinicopathologic characteristics of the patients with breast cancer

ClinicopathologiccharacteristicsnCCR7VEGF-C+-Positiverate(%)2P+-Positiverate(%)2PAge(year)1.450.2301.170.280 <5055401573411475 ≥5030181260191163Lymphnodemetastasis9.710.00212.700.001 Yes5242108144885 No33161748161748Primarytumorsize(cm)1.110.2900.740.390 ≤260431772441673 >22515106016964TNMstage6.020.0145.970.015 Ⅰ～Ⅱ40211953202050 Ⅲ～Ⅳ45351078341176ER0.170.6801.710.190 +50351570381276 -35231266221363PR0.340.5600.290.590 +48341471351373 -37241365251268

ER: estrogen receptor; PR: progesterone receptor.

4 CCR7和VEGF-C蛋白的表达与乳腺癌患者生存期之间的关系

从Kaplan-Meier生存曲线可见CCR7蛋白阳性表达者的生存期低于阴性表达者，经log-rank时序检验，两组差异有统计学显著性(P<0.05)。VEGF-C蛋白阳性表达者的生存期也明显低于阴性表达者，经log-rank时序检验，两组差异也有统计学显著性(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The relationship between the expression of CCR7 and VEGF-C and survival time of the breast cancer patients.

图3 CCR7和VEGF-C表达与乳腺癌患者生存时间的关系

讨 论

肿瘤侵袭转移是一个复杂的和多步骤的过程，很多因子参与了这一过程[4]。陈祥锦等[5]研究发现，CCR7在乳腺癌、癌旁组织及乳腺良性肿瘤中的阳性表达率分别为50.0%、18.4%和15.8%，差异有统计学显著性；且CCR7的高表达与腋窝淋巴结转移有关。本研究显示，CCR7在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于正常乳腺组织，且CCR7蛋白的高表达均与淋巴结转移、TNM分期有关，而与年龄、肿瘤大小、雌激素受体、孕激素受体均无关，说明CCR7蛋白与乳腺癌的侵袭、转移关系密切，其机制可能是CCR7与其特异性受体(CCL19和CCL21)结合后，通过激活PI3K/Akt信号通路，从而调控了肿瘤细胞的侵袭和转移。

VEGF-C 作为最早被发现的促淋巴管生成因子，具有调节血管生成、淋巴管生成和脉管通透性等作用[6]。有研究表明[7]，VEGF-C与恶性肿瘤的侵袭转移过程中肿瘤新生血管的生成关系密切。刘新兰等[8]研究表明，乳腺癌组织中hMAM、VEGF-C及VEGFR-3的阳性表达率均高于癌旁正常组织，且三者的表达与腋淋巴结转移呈正相关，而hMAM、VEGF-C及VEGFR-3在乳腺癌中的表达两两之间也均呈正相关。本研究显示，VEGF-C在乳腺癌组织中的阳性表达率也明显高于正常乳腺组织，且VEGF-C蛋白的高表达均与淋巴结转移、TNM分期有关，而与年龄、肿瘤大小、雌激素受体、孕激素受体均无关，提示VEGF-C的高达表达可能与乳腺癌的发生发展、侵袭转移有关，其具体机制可能是肿瘤细胞通过自分泌或旁分泌VEGF-C蛋白，并与VEGFR-3特异性结合后，从而提高了肿瘤细胞向远处组织侵袭、转移的能力。

经Spearman等级分析结果表明，在乳腺癌组织中，CCR7与VEGF-C蛋白的表达呈正相关关系。说明二者在促进乳腺癌向周围侵袭过程中起着协同作用，推断机制可能是VEGF-C增加淋巴管分泌CCL21，CCL21的上调可与CCR7特异性结合，从而促进表达CCR7的肿瘤细胞向淋巴管转移；同时VEGF-C的分泌还可以增加蛋白水解酶的活性和肿瘤细胞变形运动。夏欣等[9]研究发现，在卵巢癌中，VEGF-C和CCR7的表达具有显著的相关性。经log-rank时序检验发现，CCR7及VEGF-C蛋白阳性表达者的中位生存期均低于阴性表达者，差异有统计学显著性，提示二者均为乳腺癌预后的不良因素，其阳性表达患者的生存率较阴性更低，生存期可能更短，预后也可能更差。因此，联合检测CCR7及VEGF-C的表达水平，可以更加准确、客观地评价乳腺癌患者的预后，从而以此作为抗肿瘤治疗的靶点，抑制乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移，最终提高患者的生存期。

[1] 袁 磊，李伯和，时冉冉，等. 沉默JAG1基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(2):262-267.

[2] Wang J, Zhang X, Thomas SM, et al. Chemokine receptor 7 activates phosphoinositide-3 kinase-mediated invasive and prosurvival pathways in head and neck cancer cells independent of EGFR[J]. Oncogene, 2005, 24(38):5897-5904.

[3] Alitalo A,Detmar M. Interaction of tumor cells and lymphatic vessels in cancer progression [ J]. Oncogene, 2012, 31(42):4499-4508.

[4] 吴正升，吴 强. miR-183在人乳腺癌中表达及意义[J]. 中国病理生理杂志, 2012, 28(8):1358-1361.

[5] 陈祥锦，张茂泉，张惠灏，等. 三阴性乳腺癌(TNBC)组织中CCR4和CCR7的表达及意义[J]. 复旦学报：医学版, 2012, 39(6):580-584.

[6] Ishikawa M, Kitayama J, Kazama S, et al. Expression of vascular endothelial growth factor C and D (VEGF-C and -D) is an important risk factor for lymphatic metastasis in undifferentiated early gastric carcinoma[J]. JPN J Clin Oncol, 2003, 33(1):21-27.

[7] Das S, Ladell DS, Podgrabinska S, et al. Vascular endothelial growth factor-C induces lymphangitic carcinomatosis, an extremely aggressive form of lung metastases[J] .Cancer Res, 2010, 70(5):1814-1824.

[8] 刘新兰，黄 英，陈 萍，等. 人乳腺球蛋白、血管内皮生长因子-C和血管内皮生长因子受体-3在乳腺癌中的表达及其与预后的关系[J]. 第二军医大学学报, 2013, 34(10):1078-1082.

[9] 夏 欣，李鑫磊，杨树才，等. VEGF-C和CCR7的表达与卵巢癌淋巴结转移之间的关系[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2011, 20(5):472-475.

(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Expression of chemokine receptor CCR7 and VEGF-C is associated with prognosis of breast carcinoma

LIU Qing-hua1, YU Guo-hua3, LIU Yu-qing2

(1DepartmentofAnatomy,2DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China;3DepartmentofMedicalOncology,WeifangPeople’sHospital,Weifang261041,China.E-mail:yuqingliu89@hotmail.com)

AIM: To explore the protein levels of chemokine receptor 7 (CCR7) and vascular endothelial growth factor (VEGF)-C in breast carcinoma, and to investigate the effects of CCR7 and VEGF-C on prognosis of breast carcinoma. METHODS: The protein expression levels of CCR7 and VEGF-C in the breast carcinoma tissues and normal breast tissues were detected by the method of immunohistochemistry. At the same time, the relationship between clinicopathologic characteristics and the protein expression of CCR7 and VEGF-C in the breast carcinoma tissues was analyzed. The relationship between the protein expression of CCR7 and VEGF-C and survival time of the breast cancer patients was estimated by Kaplan-Meier method.RESULTS: The positive expression rates of CCR7 and VEGF-C in the breast carcinoma tissues were significantly higher than those in the normal breast tissues (P<0．01). A positive correlation was observed between the protein expression of CCR7 and the protein expression of VEGF-C in the breast carcinoma tissues (r=0.613,P<0．01). The protein expression of CCR7 and VEGF-C was correlated with lymph node metastasis and TNM stage (P<0．05), but both were not related to patients’ age, primary tumor size, estrogen receptor and progesterone receptor. The survival time of the patients with CCR7 and VEGF-C positive expression was significantly shorter than that of the patients without the expression (P<0．05).CONCLUSION: The positive expression of CCR7 and VEGF-C proteins is associated with the prognosis of breast cancer, and combined detection of CCR7 and VEGF-C protein expression levels may be helpful to judge the prognosis of breast cancer.

Chemokine receptor 7; Vascular endothelial growth factor-C; Breast carcinoma

1000- 4718(2016)08- 1457- 05

2016- 04- 22

2016- 05- 27

山东省自然科学基金资助项目(No. ZR2014HL077)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.020

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13963697599; E-mail: yuqingliu89@hotmail.com