慢病毒载体介导的降钙素基因相关肽转染对心脏干细胞活力的影响*

荣季冬， 李 玲， 龙仙萍， 邓文文， 石 蓓

(遵义医学院第一附属医院心血管内科，贵州 遵义 563003)

慢病毒载体介导的降钙素基因相关肽转染对心脏干细胞活力的影响*

荣季冬， 李 玲， 龙仙萍， 邓文文， 石 蓓△

(遵义医学院第一附属医院心血管内科，贵州 遵义 563003)

目的： 探讨携带降钙素基因相关肽(CGRP)的慢病毒体外转染对大鼠c-kitpos心脏干细胞(c-kit+CSCs)活力的影响。方法: 无菌条件下取出SD大鼠的心耳，采用酶消化法结合免疫磁珠法获取c-kit+CSCs，并通过流式细胞术鉴定；将携带目的基因的重组慢病毒载体(Lv-EGFP-CGRP)及空病毒载体(Lv-EGFP)分别转染至c-kit+CSCs，实验分为3组： Lv-EGFP-CGRP-CSCs组、Lv-EGFP-CSCs组和CSCs组；在荧光显微镜下观察转染情况，采用流式细胞技术测定其转染率，采用ELISA测定各组培养上清液中CGRP的浓度，采用CCK-8法检测慢病毒转染对c-kit+CSCs活力的影响。结果: 成功分离培养获取c-kit+CSCs，流式细胞术鉴定显示其高表达c-kit(为91.0%)，低表达CD45及CD34；成功转染慢病毒的大鼠c-kit+CSCs可表达绿色荧光，48 h后可稳定表达，感染复数(MOI)值为20时，荧光显微镜观察及流式细胞术结果均显示转染率达80%以上；ELISA结果示，Lv-EGFP-CGRP-CSCs组细胞上清液CGRP分泌量较Lv-EGFP-CSCs组和CSCs组增加(P<0.01)； CCK-8检测细胞活力的结果显示，慢病毒转染不影响c-kit+CSCs的活力。结论: 携带CGRP的慢病毒载体可成功转染至c-kit+CSCs，转染Lv-EGFP-CGRP后的c-kit+CSCs可合成和分泌CGRP蛋白至上清液中，且转染后c-kit+CSCs的活力未受影响。这为基因工程细胞疗法治疗心肌梗死提供了新的理论及实验依据。

降钙素基因相关肽； 慢病毒载体； 心脏干细胞； 细胞活力

c-kit+心脏干细胞(c-kitposcardiac stem cells，c-kit+CSCs)具有心脏组织的特异性，有向心肌细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞定向分化的潜能，被认为可能是细胞移植治疗心肌梗死最理想的种子细胞[1-3]。但干细胞移植治疗心肌梗死仍面临着诸多问题，如移植存活率低，在体内增殖、分化为有功能的细胞少，使其修复心肌的能力受到限制，远达不到预期疗效。细胞基因修饰的方法可在一定程度上提高干细胞功能，从而改善预后。研究发现降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)有抗炎、调节免疫及炎性反应、抗凋亡作用。本课题组前期研究也发现CGRP可调节急性心肌梗死后的炎症环境，从而改善梗死后心功能[4-5]。故本实验将携带CGRP的慢病毒载体转染至大鼠c-kit+CSCs使其过表达CGRP，并观察其对细胞活力的影响，以期为c-kit+CSCs移植治疗心肌梗死提供新的思路，并为进一步的体内研究打下基础。

材 料 和 方 法

1 材料

HAM’S/F-12培养液、胎牛血清(HyClone)；胰蛋白酶(Gibco)；双抗(Solarbio)；大鼠重组(人)碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor，rhbFGF)(Peprotech)；包被羊抗兔 II 抗的磁珠(Dynal Biotech)；兔抗大鼠c-kit抗体(Biorbyt)；APC标记羊抗兔 II 抗(Advansta)；PE标记小鼠抗大鼠CD45和PE标记小鼠抗大鼠CD34(Biolegend)；过表达CGRP的慢病毒载体(Lv-EGFP-CGRP)和仅含增强型GFP的慢病毒载体(Lv-EGFP)(上海英为信公司)；细胞计数CCK-8试剂盒(上海碧云天生物公司)；CGRP ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠c-kit+CSCs的分离、培养及鉴定 参考课题组前期实验[6]，取健康清洁SD大鼠(体重50～100 g)的左、右心耳， 在含有HAM’S/F-12培养液的无菌培养皿中减碎组织(大小约1 mm3)， II型胶原酶(将其用HAM’S/F-12培养液稀释成1 g/L)消化(37 ℃水浴箱，40 min)，离心(1 200 r/min，5 min)，去上清，再加入F12完全培养基接种于培养瓶中，至37 ℃、5% CO2孵箱中培养，2～3 d换液 1 次；继续培养细胞融合至80%～90%时采用磁珠分选以获取c-kit+CSCs，分选出的细胞继续培养，最后采用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度。

2.2 慢病毒转染c-kit+CSCs及其细胞上清CGRP的检测 取磁珠分选后的细胞，按每孔(3～5)×104个的细胞密度接种于24孔板中，37 ℃孵箱过夜，后吸走培养基(如果细胞生长良好、密度适宜，可不用换液)，再每孔加入1% 胎牛血清培养基500 μL，按感染复数(multiplicity of infection，MOI)值不同(5、10、20和40)分组滴加Lv-EGFP-CGRP及Lv-EGFP病毒液，混匀后培养箱37 ℃、5% CO2孵育过夜或24 h后更换成正常的培养基，分别于转染后24 h、48 h、72 h和96 h在倒置荧光显微镜下观察细胞，并人工计数转染率(每组3个复孔，每孔至少计数3个视野)；然后将计数为最佳MOI的细胞消化、离心，磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗后重悬，用流式细胞术进一步检测其转染率。

用Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP分别转染c-kit+CSCs(Lv-EGFP-CGRP-CSCs组和Lv-EGFP-CSCs组)，以单纯CSCs(CSCs组)作对照。通过ELISA检测CGRP修饰CSCs的培养上清中CGRP浓度：取磁珠分选后的细胞按5×105个的细胞密度接种于6孔板中，用MOI=20的Lv-CGRP转染CSCs 48 h并稳定表达后，弃培养基、PBS冲洗3次，重新加入培养基继续培养，48 h后收集上清行ELISA检测。按照说明书操作，用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度(A)值。

2.3 慢病毒转染后对c-kit+CSCs细胞活力的影响 将磁珠分选后的细胞按5×103个细胞密度接种于96孔板中，过夜后进行Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP病毒转染24 h后，每天分别取3组(每组6孔)行CCK-8实验，连续6 d。将检测孔中培养液吸掉，每孔加入100 μL F12完全培养基及10 μL CCK-8，37 ℃孵育2 h后于紫外分光光度计取波长450 nm进行比色，测定各孔A值。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。所有参数均用均数±标准差(mean±SD)表示，组间采用单因素方差分析和 Bonferroni校正的t检验检测组间的差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠c-kit+CSCs分离、培养及鉴定

心耳组织块经过酶消化离心后获得的单细胞悬液接种到 T25 培养瓶中培养，2 d后换液可见少量细胞贴壁生长，散在呈椭圆形或短棒状；培养至1周左右贴壁较好，细胞呈三角形、梭形、多角形。贴壁后快速向四周扩增生长，大约 13 d 可达到 80%～90%的融合。磁珠分选后3 d左右可见少量细胞贴壁，细胞表面仍可见单个或多个磁珠，大约10 d可达到 80%～90%的融合，见图1。流式细胞术检测培养的细胞，结果显示细胞表达c-kit的阳性率为91.0%，CD45阳性率4.5%，CD34阳性率4.0%，符合CSCs的表型特征，见图2。

Figure 1.Culture of rat CSCsinvitro. A: primary cells cultured for 13 d (×100); B: the cells were selected by magnetic beads for 3 d (×200); C: the cells were selected by magnetic beads for 3 d (×400).

图1 CSCs体外培养

Figure 2.c-kit+CSCs were analyzed by flow cytometry.

图2 流式细胞术鉴定c-kit+CSCs

2 慢病毒转染大鼠CSCs的转染率测定

倒置荧光显微镜下观察被转染Lv-EGFP-CGRP及Lv-EGFP成功的大鼠c-kit+CSCs可见绿色荧光的表达，48 h后即可稳定表达，时间再往后转染率、荧光强度均无明显增加(图3)；通过流式分析转染率，我们可以得出Lv-EGFP-CGRP在MOI为20时可以达到最佳转染效果，转染率为86.0%(图4)。

Figure 3.c-kit+CSCs were transfected for 48 h(×100). A: the cells were selected by magnetic beads for 13 d; B: c-kit+CSCs were transfected for 48 h; C: c-kit+CSCs were transfected for 72 h.

图3 Lv-EGFP-CGRP转染48 h后的c-kit+CSCs

Figure 4.The cell transfection efficiency was measured by flow cytometry.

图4 Lv-EGFP-CGRP转染c-kit+CSCs 48 h后流式细胞术的检测结果

3 c-kit+CSCs培养上清中CGRP的分泌水平

ELISA检测CSCs组、Lv-EGFP-CSCs及Lv-EGFP-CGRP-CSCs组上清中CGRP的分泌水平，结果显示单纯CSCs组和Lv-EGFP-CSCs组培养48 h后的上清中几乎无CGRP检出，而Lv-EGFP-CGRP-CSCs组培养48 h后的上清中有CGRP检出，浓度为25.71 ng/L，明显多于前2 组(P<0.01)，见图5。

Figure 5.The expression of CGRP in the CSCs culture supernatant was detected by ELISA. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCSCs group and Lv-EGFP-CSCs group.

图5 ELISA检测c-kit+CSCs培养上清CGRP的表达

4 病毒转染对c-kit+CSCs细胞活力的影响

通过CCK-8法检测Lv-EGFP-CSCs组、Lv-EGFP-CGRP-CSCs组和CSCs组的A值，组间相比，病毒转染后第1～6天，各组间差异无统计学显著性，见图6。

Figure 6.The effect of virus transfection on the viability of c-kit+CSCs. Mean±SD.n=3.

图6 病毒转染对c-kit+CSCs活力的影响

讨 论

心脏干细胞根据其表面标志及来源不同分为以下8种类型：c-kit+/Lin-心脏干细胞、Sca-1+心脏干细胞、Isl1+心脏干细胞、侧群细胞、心球样细胞团源性细胞、CSph、SSEA-1+心脏干细胞及EPDCs。研究发现c-kit+CSCs对心肌的修复作用最强[7]。Beltrami 等[8]证实了c-kit+CSCs可向心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞分化。Linke等[9]发现，在犬的心脏组织中c-kit+细胞所占心脏干细胞比例最大，分化能力也是最强。c-kit+CSCs是最早发现的CSCs，与其它CSCs相比，其分化为心肌细胞的能力最强，对心脏修复能力也最强。如何分离提取高纯度的c-kit+CSCs成为心肌梗死后细胞疗法的关键。目前对于c-kit+CSCs分离、培养方法各家报道均不一致，但由于c-kit+CSCs多存在于心脏的心耳中[10-11]，故本实验取材大鼠心耳。采用心耳消化法[12]经胶原酶消化后直接通过单细胞培养，与既往的培养方法相比，避免了细胞从组织块中缓慢逐渐爬出的过程，缩短了细胞培养周期，且获取的细胞量更多。获取的细胞再通过免疫磁珠分选法获取c-kit+CSCs。使用流式细胞术检测所培养细胞的表面标志物(c-kit、CD45和CD34)，结果显示：c-kit高表达，为91.0%；CD34和CD45极低表达，分别为4.0%和4.5%，说明通过本实验的细胞培养方法可得到纯度较高的c-kit+CSCs。

尽管c-kit+CSCs被证实有修复心肌的作用，但心肌梗死后移植CSCs存活数量的减少及死亡的增加都使得CSCs迁移、增殖及分化作用受到极大的限制，大大地减弱了其对心肌梗死的治疗效果。而细胞基因修饰可在一定程度上改善这一现状。Huang等[13]研究发现CGRP基因敲除鼠缺血再灌注损伤后心功能显著降低，这提示它与心肌的内源性保护作用有关。此外，有研究发现CGRP可通过促进VEGF、IGF、HGF等血管生长因子的分泌发挥强大的心血管保护作用(促内皮化及血管发生)，而这些血管生长因子可促进c-kit+CSCs的增殖、存活及分化而发挥心肌修复作用，减小心肌梗死面积，改善心功能[14-15]。这提示我们CGRP与c-kit+CSCs存在某种关联，因此选择CGRP为目的基因修饰c-kit+CSCs。

如何选择合适的载体来进行c-kit+CSCs的基因修饰呢？目前的基因载体有腺病毒、慢病毒和质粒，其中慢病毒载体较其它病毒载体具有既可感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞，还可整合于宿主基因组内，并随细胞基因组的分裂而分离，实现基因稳定长效表达，感染效率更高，容纳外源性目的基因片段大，免疫原性小，生物安全性好等优点，可作为基因治疗的理想载体[16-17]。携带CGRP的慢病毒是否可在体外成功转染c-kit+CSCs呢？通过对慢病毒自身携带的EGFP进行观察、检测进一步明确其转染是否成功。当然首先是确定转染c-kit+CSCs所需病毒的最佳MOI。目前认为MOI是指病毒载体转染细胞时病毒与细胞的比值，MOI值随靶细胞不同、实验条件不同而有一定变化。本实验按MOI=5、10、20、40对靶细胞进行转染，在24 h、48 h、96 h及120 h用荧光显微镜观察其绿色荧光的表达量、细胞形态，明暗视野计数来计算转染率。结果发现MOI值为20时细胞形态及生长未受到抑制，48 h后荧光表达稳定。此时用流式细胞术测转染效率也得到较满意的结果(达86.0%)。因此，选择MOI=20为最佳感染复数。转染后的c-kit+CSCs是否有分泌CGRP蛋白的功能呢？本实验对成功转染病毒的c-kit+CSCs上清进行ELISA检测，结果显示以MOI=20转染c-kit+CSCs后48 h，重新换液的培养基中48 h CGRP分泌量达高峰，为25.71 ng/L，而单纯c-kit+CSCs和空病毒转染c-kit+CSCs的培养上清中几乎没有CGRP的分泌。本实验应用CCK-8法检测CGRP对细胞活力的影响，结果显示Lv-EGFP-CGRP-CSCs组与CSCs组及Lv-EGFP-CSCs组比较，其细胞活力无明显差异。说明经CGRP基因修饰的CSCs的生长能力与CSCs组和Lv-EGFP-CSCs组无差异。

综上所述，经慢病毒介导的目的基因CGRP可成功导入c-kit+CSCs，且转染后的c-kit+CSCs可稳定表达绿色荧光蛋白，并能分泌CGRP，除此外慢病毒转染c-kit+CSCs后其生长能力不受影响。这些为接下来的体内实验奠定了基础。提示c-kit+CSCs是一种理想的基因载体细胞，可作为CGRP基因转染的靶细胞用于基因治疗。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Transfection of calcitonin gene-related peptide mediated by lentivirus vectorinvitroand its effects on cardiac stem cell viability

RONG Ji-dong, LI Ling, LONG Xian-ping, DENG Wen-wen, SHI Bei

(DepartmentofCardiology,TheFirstAffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail:shibei2147@163.com)

AIM: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP)transfection into c-kitposcardiac stem cells (c-kit+CSCs) on the cell viability. METHODS: Under the sterile condition, the auricles of SD rats were taken out,and then c-kit+CSCs were collected through enzyme digestion and immunomagnetic bead separation (MACS). The cells were identified by flow cytometry. c-kit+CSCs were transfected with enhanced green fluorescent protein CGRP lentiviral vector (Lv-EGFP-CGRP) or enhanced green fluorescent protein lentiviral vector (Lv-EGFP). The cells were randomly divided into Lv-EGFP-CGRP-CSCs group, Lv-EGFP-CSCs group and CSCs group. The transfection was observed under the fluorescence microscope. The transfection efficiency was detected by flow cytometry. The CGRP protein secretion in the cell culture supernatants was detected by ELISA. The viability of c-kit+CSCs transfected with Lv-EGFP-CGRP or Lv-EGFP was measured by CCK-8 assay. RESULTS: c-kit+CSCs were isolated and cultured successfully. The expression positive rate of c-kit was 91.0% and the expression positive rates of CD45 and CD34 were 4.5% and 4.0%, respectively. After transfected with lentivirus for 48 h, the stable fluorescence in c-kit+CSCs was observed under fluorescence microscope. The transfection efficiency were 80% when MOI was 20. The level of CGRP was significantly increased in Lv-ECFP-CGRP-CSCs group compared with Lv-EGFP-CSCs group and CSCs group (P<0.05). Meanwhile, transfection with lentiviral vector in each group did not affect the viability of c-kit+CSCs. CONCLUSION: Transfection of Lv-EGFP-CGRP into c-kit+CSCs was successful. The secretion of CGRP was found in the transfected c-kit+CSCs and the viability was not changed after transfection. CGRP-modified c-kit+CSCs may play a role in treating myocardial infarction．

Calcitonin gene-related peptide; Lentiviral vector; Cardiac stem cell; Cell viability

1000- 4718(2016)08- 1445- 06

2016- 01- 20

2016- 05- 30

国家自然科学基金资助项目(No. 81360021)；贵州省国际合作项目[黔科合外G字(2013)7037号]

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.018

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0851-28608406； E-mail: shibei2147@163.com