ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制坏死性凋亡介导的高糖致H9c2心肌细胞炎症中的作用*

梁伟杰， 陈美姬， 何健华， 张稳柱， 程 飞， 兰 军， 冯鉴强， 黄惠敏△

(1广州市番禺区中心医院心血管内科，2广州市番禺区心血管疾病研究所，广东 广州 511400；3中山大学附属第一医院黄埔院区儿科，广东 广州 510700； 4广州市番禺区石碁人民医院心血管内科，广东 广州 511450； 5东莞市第三人民医院心血管内科，6东莞市心血管疾病研究所，广东 东莞 523326)

ATP敏感性钾通道在硫化氢抑制坏死性凋亡介导的高糖致H9c2心肌细胞炎症中的作用*

梁伟杰1, 2， 陈美姬3， 何健华4， 张稳柱1, 2， 程 飞5, 6， 兰 军5, 6， 冯鉴强5, 6， 黄惠敏1, 2△

(1广州市番禺区中心医院心血管内科，2广州市番禺区心血管疾病研究所，广东 广州 511400；3中山大学附属第一医院黄埔院区儿科，广东 广州 510700；4广州市番禺区石碁人民医院心血管内科，广东 广州 511450；5东莞市第三人民医院心血管内科，6东莞市心血管疾病研究所，广东 东莞 523326)

目的： 探讨ATP敏感性钾通道(KATP通道)在硫化氢(H2S)抑制坏死性凋亡介导的高糖(HG)致H9c2 心肌细胞炎症中的作用。方法: 应用Western blot法测定受体相互作用蛋白3(RIP3)和环氧化酶-2(COX-2)的表达水平；ELISA检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的水平。结果: H9c2 心肌细胞经HG (35 mmol/L葡萄糖)处理24 h，其RIP3 的表达水平明显升高，100 μmol/L KATP通道开放剂二氮嗪(DZ)和400 μmol/L H2S的供体硫氢化钠(NaHS)预处理心肌细胞30 min均可抑制HG对RIP3 表达的上调；100 μmol/L KATP通道阻断剂5-羟基癸酸(5-HD)预处理心肌细胞30 min可阻断NaHS对HG上调RIP3 表达的抑制作用。另一方面，100 μmol/L坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1共处理或100 μmol/L DZ、400 μmol/L NaHS预处理心肌细胞均能抑制高糖引起的心肌细胞炎症，使COX-2 表达及IL-1β和TNF-α的分泌水平均减少；而100 μmol/L 5-HD能明显拮抗NaHS的上述抗炎症反应作用。结论: KATP通道在H2S抑制坏死性凋亡介导的高糖致心肌细胞炎症反应中发挥重要的作用。

ATP敏感性钾通道； 硫化氢； 坏死性凋亡； 高糖； 心肌细胞； 炎症

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一种严重的糖尿病心血管并发症，是引起糖尿病病人心力衰竭和死亡的主要原因，受到全球的广泛关注。DCM的发病涉及多方面的机制，如氧化应激、心肌纤维化、慢性炎症和心肌细胞死亡等[1]。研究表明，在DCM患者或动物模型中，持续存在的炎症反应伴随大量的炎症细胞因子如白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌及与炎症相关的信号分子，如核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等的激活，最终导致心肌损伤[2-4]。另一方面，心肌细胞死亡在DCM的发生过程中起关键的开启作用。坏死性凋亡(necroptosis)也称为程序性坏死(programmed necrosis)，是近年来新发现的一种细胞死亡方式。在坏死性凋亡发生过程中，受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein，RIP)家族，尤其是RIP3起重要的作用，过量表达的RIP3可导致坏死性凋亡的发生[5]。有报道指出，坏死性凋亡和细胞炎症反应的关系非常密切。Liu等[6]证实，坏死性凋亡的特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)可减轻小鼠结肠癌细胞的炎症反应，提示坏死性凋亡可介导细胞的炎症反应。但是，在DCM的病理生理机制中，坏死性凋亡和炎症的关系如何目前尚未完全明确，因此，研究这个问题有重要的理论和临床意义。

ATP敏感性钾通道(ATP-sensitive K+channel，KATP通道)是Noma于1983年首先在豚鼠的心肌细胞中发现的，广泛存在于心肌细胞、骨骼肌细胞和血管平滑肌细胞中。多项研究表明，开放KATP通道对心肌有明确的保护作用[7-9]。新型气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)是KATP通道的开放剂[10]，能保护H9c2心肌细胞对抗高糖引起的心肌细胞毒性、凋亡、氧化应激、线粒体功能受损及炎症等损伤[11-14]。最近，我们证实，H2S通过调控KATP通道[12]及抑制坏死性凋亡对抗高糖引起的心肌细胞损伤[14]，然而，KATP通道是否参与H2S对炎症反应及坏死性凋亡的抑制，迄今未见报道。

为此，本研究建立高糖损伤H9c2心肌细胞模型[11]，重点探讨以下问题：(1)坏死性凋亡是否介导高糖致心肌细胞炎症反应；(2)开放KATP通道能否抑制坏死性凋亡介导的炎症反应；(3)KATP通道在H2S抑制坏死性凋亡介导的心肌细胞炎症反应中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

Nec-1和硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)由Sigma-Aldrich供应；抗RIP3 抗体和抗COX-2 抗体购自CST；二氮嗪(diazoxide, DZ)和5-羟基癸酸(5-hydroxydecanoic acid，5-HD)购自Cayman；特级胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco BRL；DMEM培养基(其葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)由HyClone供应；TNF-α和IL-1β ELISA试剂盒由武汉华美生物工程有限公司提供。H9c2心肌细胞来源于胚胎期大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，由中山大学实验动物中心供应。

2 方法

2.1 细胞培养 H9c2心肌细胞置于含10% FBS的DMEM培养基中，于5% CO2、37 ℃的条件下传代培养，待细胞生长至约80%的融合状态可用于实验。

2.2 实验分组 实验分为10组：(1)正常对照(control)组采用DMEM培养基作用心肌细胞24 h；(2)高糖(high glucose，HG)组用含有高浓度葡萄糖(35 mmol/L)的DMEM培养基作用心肌细胞24 h；(3) NaHS+HG组用400 μmol/L NaHS预处理心肌细胞30 min，PBS液洗2次后，用含高浓度葡萄糖的DMEM培养基作用24 h；(4) 5-HD+NaHS+HG组用100 μmol/L 5-HD作用心肌细胞30 min，撤去，PBS洗2次，后续步骤与第(3)实验组相同；(5) DZ+HG组用100 μmol/L DZ预处理心肌细胞30 min，PBS液洗2次后，用含高浓度葡萄糖的DMEM培养基作用24 h；(6) Nec-1+ HG组用100 μmol/L Nec-1与含高浓度葡萄糖的DMEM培养基共处理心肌细胞24 h；(7) NaHS组用400 μmol/L NaHS作用心肌细胞30 min，PBS洗2次，接着DMEM培养基处理24 h；(8) 5-HD组用100 μmol/L 5-HD作用心肌细胞30 min，PBS洗2次，接着DMEM培养基处理24 h；(9) DZ组用100 μmol/L DZ作用心肌细胞30 min，撤去，PBS洗2次，接着DMEM培养基处理24 h；(10) Nec-1组用100 μmol/L Nec-1与DMEM培养基共处理心肌细胞24 h。

2.3 Western blot法检测RIP3 和COX-2 的表达水平 在60 mm培养皿中种植H9c2 心肌细胞，待细胞生长至大约80%的融合度时，根据实验分组给予相应处理后，加入细胞裂解液，4 ℃的摇床上作用30 min，12 000 r/min高速离心10 min，以BCA法测定蛋白质含量。等量的蛋白经10%SDS-PAGE分离后，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Ⅰ抗，即兔抗鼠RIP3、COX-2或GAPDH(浓度均为1∶1 000)，4 ℃作用过夜后加入浓度为1∶2 500的Ⅱ抗稀释液，室温下孵育1.5 h，ECL法使PVDF膜显色，暗室中将显色条带曝光到医用X线片上，凝胶成像扫描系统分析结果。实验重复5次。

2.4 ELISA检测细胞培养液中IL-1β和TNF-α的水平 于96孔板中种植H9c2 心肌细胞，待细胞融合度达到约80%时，按照分组给予不同的处理后，收集培养基留作待测标本。ELISA操作流程根据试剂盒说明书进行，在终止显色反应后，用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度(A)值。取5孔A值的平均数，根据以下公式计算出IL-1β和TNF-α的诱导释放率(%)：处理组A/对照组A×100%。实验重复5次。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计数据处理和分析，计量资料采用均数±标准误(mean±SEM)表示，单因素方差分析(one-way ANOVA)用于多个样本均数间的比较，SNK-q检验用于多个样本均数间的两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 KATP通道开放剂抑制HG诱导的心肌细胞RIP3表达增加

图1显示，H9c2心肌细胞经HG (35 mmol/L葡萄糖)作用24 h后，其RIP3的表达明显增加，与control组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。应用100 μmol/L DZ(KATP通道开放剂)预处理心肌细胞30 min后再予HG作用心肌细胞24 h，RIP3的表达明显减少，与HG组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。100 μmol/L DZ本身对心肌细胞RIP3的基础表达无明显影响。

Figure 1.KATPchannel opener diazoxide (DZ) attenuated high glucose (HG)-induced up-regulation of RIP3 in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

图1 KATP通道开放剂抑制HG诱导的心肌细胞RIP3表达增加

2 KATP通道介导H2S对HG上调RIP3表达的抑制作用

如前所述，HG可明显上调RIP3的表达；在HG处理心肌细胞前，应用400 μmol/L NaHS预处理心肌细胞30 min可使RIP3的表达明显减少，与HG处理组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。但是，在NaHS预处理前，应用100 μmol/L 5-HD(KATP通道阻断剂)作用心肌细胞30 min，可使NaHS对RIP3表达的抑制作用减弱，与NaHS预处理组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS或100 μmol/L 5-HD本身对心肌细胞RIP3的基础表达无明显的影响，见图2。

Figure 2.KATPchannels contributed to the inhibitory effect of H2S on HG-induced increase in RIP3 expression in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+NaHS group.

图2 KATP通道介导H2S抑制HG诱导的心肌细胞RIP3表达增加

3 坏死性凋亡抑制剂和KATP通道开放剂抑制HG诱导的心肌细胞COX-2 表达上调

HG作用心肌细胞24 h可明显上调COX-2的表达，与对照组比较，两者差异有统计学显著性(P<0.01)。但是，应用100 μmol/L Nec-1(坏死性凋亡的特异性抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h可明显拮抗HG对COX-2表达的上调作用，与HG组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。100 μmol/L Nec-1本身对心肌细胞COX-2的基础表达无明显影响。

与Nec-1的作用相类似，100 μmol/L DZ预处理心肌细胞也能明显地抑制HG对COX-2表达的上调，与HG组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。100 μmol/L DZ本身对心肌细胞COX-2的基础表达无明显影响,见图3。

Figure 3.The inhibitor of necroptosis (A) and KATPchannel opener (B) attenuated HG-induced up-regulation of COX-2 in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group.

图3 坏死性凋亡抑制剂和KATP通道开放剂抑制HG诱导的心肌细胞COX-2表达上调

4 KATP通道介导H2S对HG促进COX-2表达的抑制作用

如前所述，HG可促进COX-2的表达；应用400 μmol/L NaHS预处理心肌细胞30 min，可使COX-2 的表达明显减少，与HG处理组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。但是，在NaHS预处理前，应用100 μmol/L 5-HD预处理心肌细胞30 min可使NaHS对COX-2表达的抑制作用明显减弱，与NaHS预处理组比较，差异有统计学显著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS或100 μmol/L 5-HD本身对心肌细胞COX-2的基础表达无明显的影响,见图4。

Figure 4.KATPchannels contributed to the inhibitory effect of H2S on HG-induced increase in the expression of COX-2 in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+NaHS group.

图4 KATP通道介导H2S抑制HG诱导的心肌细胞COX-2 表达上调

5 KATP通道参与H2S对坏死性凋亡介导的HG致炎症细胞因子分泌的抑制

如图5所示，HG处理心肌细胞24 h可明显促进炎症细胞因子IL-1β和TNF-α的分泌，与control组比较，差异均有统计学显著性(P<0.01)。应用100 μmol/L Nec-1共处理或100 μmol/L DZ预处理心肌细胞能拮抗HG对炎症细胞因子分泌的促进作用，使IL-1β和TNF-α的分泌水平降低，与HG组分别比较，差异均有统计学显著性(P<0.01)。100 μmol/L Nec-1或100 μmol/L DZ本身不影响炎症细胞因子的基础分泌。

与Nec-1或DZ抑制炎症细胞因子分泌的作用相类似，应用400 μmol/L NaHS预处理心肌细胞30 min也可使IL-1β和TNF-α的分泌水平明显降低，与HG组比较，差异均有统计学显著性(P<0.01)。但是，在NaHS预处理前，应用100 μmol/L 5-HD作用心肌细胞30 min可明显拮抗NaHS对HG诱导炎症细胞因子分泌的抑制作用，使IL-1β和TNF-α的分泌水平升高，与NaHS预处理组比较，差异均有统计学显著性(P<0.01)。400 μmol/L NaHS或100 μmol/L 5-HD本身对炎症细胞因子的基础分泌无明显的影响。

Figure 5.KATPchannels mediated the inhibitory effect of H2S on HG-induced secretion of inflammatory cytokines mediated by necroptosis in H9c2 cardiac cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsHG group;△△P<0.01vsHG+NaHS group.

图5 KATP通道参与H2S抑制坏死性凋亡介导的高糖致心肌细胞炎症细胞因子分泌

讨 论

炎症反应是高血糖引起心肌损伤的一个重要的病理生理机制。和我们之前的报道[12]及其它的研究结果[2-4]相一致，本研究再次证实，HG可引起明显的心肌细胞炎症反应，表现为炎症细胞因子IL-1β、TNF-α的分泌水平升高和炎症通路COX-2的激活。生理状态下COX-2在绝大部分组织细胞中是鲜有表达的，在炎症、缺氧、高血糖、肿瘤等病理状态下则表达呈增高趋势，诱导合成前列腺素类衍生物，是诱导炎症反应的一种重要的信号分子。研究表明，细胞炎症和坏死性凋亡的关系非常密切。最近，我们证实坏死性凋亡参与HG引起的心肌细胞损伤[14]。但是，坏死性凋亡是否参与HG引起的心肌细胞炎症尚不清楚。因此，在本研究中，我们观察了坏死性凋亡的特异性抑制剂Nec-1对HG诱导的心肌细胞炎症的影响，结果表明Nec-1可明显抑制HG引起的心肌细胞炎症反应，使炎症细胞因子的分泌和COX-2的表达减少，清晰地提示坏死性凋亡可介导HG诱导的H9c2心肌细胞炎症。Liu等[6]在结肠癌细胞(HT-29细胞)模型的研究结论与本文相似，且我们首次证实，在HG损伤心肌细胞的条件下，坏死性凋亡可激活COX-2通路，这可能是坏死性凋亡介导炎症的一个重要机制，但尚需进一步的探讨。

KATP通道是一种受细胞内ATP浓度调控的内向整流钾通道，其活性状态主要决定于胞内ATP与ADP的浓度。心肌细胞KATP通道的激活可通过缩短动作电位时程、减少钙超载、减少能量消耗、抑制线粒体渗透性转换孔开放等机制，发挥心肌保护作用。因坏死性凋亡可引起细胞内ATP浓度的变化[15]，因此我们推测KATP通道可能对坏死性凋亡有一定的调控作用。为了验证我们的假设，我们首先观察了KATP通道开放剂DZ对HG上调RIP3表达的影响。结果表明，DZ可明显地拮抗HG对RIP3 表达的上调作用。此外，应用DZ预处理心肌细胞和应用坏死性凋亡的特异性抑制剂Nec-1共处理心肌细胞均产生类似的抗炎症反应作用，使IL-1β、TNF-α的分泌和COX-2的表达减少。上述结果提示，开放KATP通道可抑制坏死性凋亡及其介导的心肌细胞炎症反应。

重要的是，我们进一步探讨了高糖状态下，KATP通道在H2S抑制坏死性凋亡介导的心肌细胞炎症中的作用。H2S是继CO和NO之后被发现的第3种内源性气体信号分子，具有多种病理生理作用。H2S是KATP通道的开放剂[10]，可通过调控KATP通道实现细胞保护作用。例如，H2S可激活KATP通道减轻缺氧对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的损伤[16]；Bian等[17]报道，KATP通道介导H2S对缺血引起大鼠心肌细胞损伤的抑制作用；我们最近证实，H2S可通过开放KATP通道对抗HG引起的H9c2心肌细胞损伤[13]。为了探讨KATP通道是否介导H2S对HG诱发的心肌细胞炎症的抑制作用，本研究在上述研究的基础上，进一步观察KATP通道阻断剂5-HD预处理心肌细胞对H2S抑制HG致心肌细胞炎症反应的影响。结果表明，5-HD可明显减弱H2S的抗坏死性凋亡和抗炎症反应作用，使RIP3和COX-2表达水平明显上升，IL-1β和TNF-α分泌增多，提示在高糖状态下，通过激活KATP通道继而抑制坏死性凋亡介导的心肌细胞炎症反应，可能是H2S发挥其保护心肌细胞对抗HG引起的炎症反应的重要机制之一，这为深入阐明H2S的抗炎症机制提供了新颖的实验依据。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Role of ATP-sensitive potassium channels in inhibitory effect of hydrogen sulfide on high glucose-induced inflammation mediated by necroptosis in H9c2 cardiac cells

LIANG Wei-jie1, 2, CHEN Mei-ji3, HE Jian-hua4, ZHANG Wen-zhu1, 2, CHENG Fei5, 6, LAN Jun5, 6, FENG Jian-qiang5, 6, HUANG Hui-min1, 2

(1DepartmentofCardiology,CentralHospitalofPanyuDistrict,2CardiovascularInstituteofPanyuDistrict,Guangzhou511400,China;3DepartmentofPediatrics,HuangpuDivision,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510700,China;4DepartmentofCardiology,ShiqiPeople’sHospitalofPanyuDistrict,Guangzhou511450,China;5DepartmentofCardiology,TheThirdPeople’sHospitalofDongguanCity,6CardiovascularInstituteofDongguanCity,Dongguan523326,China.E-mail: 9090430@qq.com)

AIM: To investigate the role of ATP-sensitive potassium (KATP) channels in the inhibitory effect of hydrogen sulfide (H2S) on high glucose(HG)-induced inflammation mediated by necroptosis in H9c2 cardiac cells.METHODS: The expression levels of receptor-interacting protein 3 (RIP3; an indicator of necroptosis) and cyclooxyge-nase-2 (COX-2) were determined by Western blot. The levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were detected by ELISA.RESULTS: After H9c2 cardiac cells were treated with 35 mmol/L glucose (HG) for 24 h, the expression of RIP3 was significantly increased. Pre-treatment of the cells with 100 μmol/L diazoxide (DZ; a KATPchannel opener) or 400 μmol/L NaHS (a donor of H2S) for 30 min considerably blocked the up-regulation of RIP3 induced by HG. Moreover, pre-treatment of the cells with 100 μmol/L 5-hydroxydecanoic acid (5-HD; a KATPchannel blocker) attenuated the inhibitory effect of NaHS on HG-induced up-regulation of RIP3. On the other hand, co-treatment of the cells with 100 μmol/L necrostatin-1 (a specific inhibitor of necroptosis) or pre-treatment of the cells with 100 μmol/L DZ or 400 μmol/L NaHS attenuated HG-induced inflammatory responses, evidenced by decreases in the expression of COX-2 and secretion levels of IL-1β and TNF-α. However, pre-treatment of the cells with 100 μmol/L 5-HD significantly attenuated the above anti-inflammatory effects of NaHS.CONCLUSION: KATPchannels play an important role in the inhibitory effect of H2S on HG-induced inflammation mediated by necroptosis in H9c2 cardiac cells.

ATP-sensitive potassium channel; Hydrogen sulfide; Necroptosis; High glucose; Cardiomyocyte; Inflammation

1000- 4718(2016)08- 1364- 06

2016- 04- 05

2016- 05- 06

广东省自然科学基金资助项目(No. 2015A030313690)；番禺区科技计划项目(No. 2015-Z03-57)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.004

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△通讯作者 Tel: 020-34859342; E-mail： 9090430@qq.com