miR-625-3p在结肠癌组织和细胞中的表达*

郑海伦， 赵 睿， 李大鹏， 汪强武， 汪建超， 王启之

(蚌埠医学院第一附属医院消化科，安徽 蚌埠 233004)

miR-625-3p在结肠癌组织和细胞中的表达*

郑海伦， 赵 睿， 李大鹏， 汪强武， 汪建超， 王启之△

(蚌埠医学院第一附属医院消化科，安徽 蚌埠 233004)

目的： 探讨微小RNA(miR)-625-3p在结肠癌组织和细胞中的表达，了解其作用机制。方法: 利用qRT-PCR分析结肠癌细胞株、癌组织和癌旁组织中miR-625-3p的表达水平，探讨miR-625-3p表达水平与结肠癌临床病理参数之间的关系；利用碘化丙啶染色和流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期变化；Western blot法检测miR-625-3p对结肠癌细胞株凋亡相关蛋白的影响，初步了解其发挥影响的可能机制。结果: 结肠癌组织miR-625-3p的表达量比癌旁组织高(P<0.05)，miR-625-3p的表达量与结肠癌浸润深度、TNM分期及有无远处转移关系密切(P<0.05)。miR-625-3p在结肠癌SW620细胞中的表达水平高于在SW480细胞中的表达。抑制miR-625-3p的表达能显著抑制结肠癌细胞的周期(P<0.05)和促进凋亡；转染miR-625-3p后， Bcl-2的表达量增加(P<0.05)，Bax表达量没有显著变化。结论: miR-625-3p能促进结肠癌细胞增殖，抑制结肠癌细胞凋亡，可能是结肠癌新的抗癌靶点。

结肠癌； 微小RNA-625-3p； 细胞周期； 细胞凋亡

结肠癌是消化系统高发肿瘤之一，其发生机制复杂，目前仍未完全明了，既往研究发现其发生与一系列癌基因激活和抑癌基因失活等变化有关[1]；其中微小RNA(microRNAs,miRNAs)在肿瘤的发生发展中也起到了重要作用，包括细胞增殖、分化、血管发生、凋亡、侵袭转移等[2-3]。miRNAs 表达异常可能会导致相应的蛋白表达异常，这些异常表达的蛋白能发挥抑癌或促癌作用[4-5]。近来的研究发现miRNA-625-3p(miR-625-3p)能影响奥沙利铂对结肠癌患者的疗效[6]，而且miR-625-3p能促进结肠癌细胞的侵袭和转移[7]，同时也发现在恶性胸膜间皮瘤患者血循环中miR-625-3p水平升高[8]。然而miR-625-3p在结肠癌的发生发展中的作用仍不明确，值得进一步研究和探讨。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

DMEM培养液、胰蛋白酶购自Gibco；人结肠癌细胞株SW480和SW620 购自中科院上海细胞库，由安徽省生化药物工程技术研究中心冻存；miR-625-3p模拟物(miR-625-3p mimics)、阴性对照(negative control, NC)模拟物、miR-625-3p 抑制剂(anti-miR-625-3p)、对照抑制剂(anti-NC)、 Lipofectamine 2000和TRIzol试剂购自Invitrogen；iScriptTMcDNA Synthesis Kit 购自Bio-Rad；ABI StepOneTMReal-Time PCR System购自 Applied Biosystems；鼠抗人Bcl-2、Bax和β-actin抗体购自 Santa Cruz。

2 研究对象

收集2013年1月～2015年6月在我院110例确诊结肠癌的患者肿瘤组织及癌旁组织。结肠癌毗邻正常组织(癌旁组织)的取材标准为距离肿瘤边缘至少5 cm的正常结肠黏膜组织。所有患者均未行术前辅助化疗或放射治疗，没有其它恶性肿瘤疾病。结肠癌临床分期参照中国结直肠癌诊疗规范、美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠癌TNM分期系统标准进行分期。

3 主要方法

3.1 细胞培养 来源于结肠癌原发部位的肿瘤细胞系SW480和来源于同一结肠癌患者的转移淋巴结肿瘤细胞系SW620由安徽省生化药物工程技术研究中心冻存。复苏后于含10% 胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内传代培养，待细胞生长状态良好时用于实验。

3.2 RNA提取和qRT-PCR 利用TRIzol试剂分别提取结肠癌、结肠癌毗邻正常组织(癌旁组织)、SW480和SW620细胞中的总RNA。取含100 ng总RNA按iScriptTMcDNA Synthesis Kit操作说明书进行反转录cDNA。按TaqMan MicroRNA Assays说明检测成熟miRNA，以miR-625-3p和U6为模板，miR-625-3p和U6荧光探针作引物扩增，在ABI StepOneTMReal-Time PCR System中进行反应。所有实验重复3次，相对定量用2-ΔΔCt法分析miRNA的变化。

3.3 miR-625-3p 的转染 miR-625-3p mi-mics和对照NC按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书转染进入SW480细胞。Anti-miR-625-3p和对照抑制剂anti-NC按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书转染进入SW620细胞。转染48 h后收集细胞，利用RT-qPCR 法检测转染后miR-625-3p的表达。

3.4 对细胞增殖的影响 将分别转染 miR-625-3p mimics、NC的SW480细胞和分别转染anti-miR-625-3p、anti-NC的SW620细胞接种于6孔板中，终浓度为1×107/L，分别培养24 h、48 h、72 h后，收集细胞，计数活细胞数量。每组3个复孔，重复3次。

3.5 对细胞周期的影响 将分别转染 miR-625-3p mimics、NC的SW480细胞和分别转染anti-miR-625-3p、anti-NC的SW620细胞接种于6孔板中，培养24 h后，收集细胞，预冷 PBS 洗涤 1 次，离心去除PBS，加入预冷的 70% 的乙醇固定细胞24 h，离心弃去固定液，PBS 洗涤 1 次后收集细胞于流式管，每管细胞样品中加入1 mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(含有100 mg/L RNase A和5 mg/L PI)，缓慢并充分重悬细胞，避光室温孵育30 min，随后用流式细胞仪在488 nm激发波长下检测红色荧光和光散射情况，并用Flowjo软件分析细胞周期。实验重复3次。

3.6 细胞凋亡检测 将分别转染 miR-625-3p mi-mics、NC的SW480细胞和分别转染anti-miR-625-3p、anti-NC的SW620细胞接种于6孔板中，每孔1×105个细胞，继续培养24 h后获取细胞，加入75%的冷乙醇固定，4 ℃过夜。测试前用PBS洗涤2次，每组加入600 μL PI缓冲液(5 mg PI,0.1 g NaC6H5,100 μL Triton X-100,100 μL ddH2O)，避光染色30 min，用流式细胞仪检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。实验重复3次。

3.7 Western blot法检测凋亡蛋白的表达 接种已转染的细胞于6孔细胞培养板中。处理24 h 后消化收集细胞，用预冷PBS洗2 次。按照试剂盒说明书步骤行Western blot实验检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的变化。

4 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，计数资料比较采用卡方检验，两组间计量资料比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-625-3p在结肠癌组织中的表达

通过收集结肠癌组织及癌旁组织，并检测组织中miR-625-3p相对表达含量，结肠癌组织miR-625-3p表达量比癌旁组织表达量高，平均高出(6.16±1.08)倍，差异有统计学显著性(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of miR-625-3p in colorectal cancer tissues. Mean±SD.n=110.*P<0.05vsnormal tissues.

图1 miR-625-3p在结肠癌组织中的表达

2 结肠癌miR-625-3p的表达量与临床病理参数之间的关系

将患者的临床病理参数年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、TNM分期及有无远处转移与miR-625-3p的相对含量比较发现：miR-625-3p相对表达量与肿瘤浸润深度、TNM分期和远处转移有相关性(P<0.01)，与患者年龄、性别、肿瘤大小的相关性无统计学显著性，见表1。

3 miR-625-3p在结肠癌细胞中的表达

实验结果表明miR-625-3p在结肠癌SW620细胞中的表达比来源于结肠癌原发部位的SW480细胞高(P<0.05)。miR-625-3p 模拟物转染进入SW480细胞后结果显示SW480细胞中miR-625-3p表达较对照组高(P<0.05)。miR-625-3p 抑制剂转染进入SW620细胞后结果显示miR-625-3p在SW620细胞中的表达较对照组低(P<0.05)，见图2。

表1 结肠癌miR-625-3p表达与临床病理参数之间的关系

4 miR-625-3p对结肠癌细胞增殖的影响

转染miR-625-3p后SW480细胞随着实验时间延长，增殖活性明显增强，在实验后24 h、48 h、72 h时均具有统计学显著性(P<0.05)。与anti-NC组相比，转染anti-miR-625-3p后SW620细胞随着实验时间延长，增殖活性减弱，在实验后24 h两者无显著性差异，实验48 h、72 h时差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

5 miR-625-3p对结肠癌细胞周期的影响

结肠癌SW480细胞转染miR-625-3p模拟物后，用Flowjo软件分析细胞周期，发现G0/G1期与S期细胞比例都没有明显变化，但是G2/M期与对照组相比比例升高，差异具有统计学显著性(P<0.05)。SW620细胞转染miR-625-3p抑制剂及阴性对照抑制剂后，用Flowjo软件分析细胞周期发现G0/G1期与阴性对照组相比比例升高，差异具有统计学显著性(P<0.05)；S 期细胞比例变化不明显；G2/M期与阴性对照组相比比例降低，差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图4。

Figure 2.The expression of miR-625-3p in different CRC cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsSW480;#P<0.05vsNC;△P<0.05vsanti-NC.

图2 miR-625-3p在不同转移潜能的结肠癌细胞中的表达

Figure 3.The effects of miR-625-3p on the CRC cell proliferation. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

图3 miR-625-3p对结肠癌细胞增殖的影响

Figure 4. The effects of miR-625-3p on the CRC mitotic cycle. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

图4 miR-625-3p对结肠癌细胞周期的影响

6 miR-625-3p对细胞凋亡的影响

流式细胞术分析SW620细胞转染miR-625-3p抑制剂及阴性对照抑制剂后，发现转染miR-625-3p抑制剂后的细胞凋亡率比阴性对照组细胞凋亡率要高，差异具有统计学显著性(P<0.05)，说明抑制miR-625-3p能促进细胞凋亡。但是SW480细胞转染miR-625-3p模拟物与对照组相比，细胞凋亡率没有明显变化，见图5。

Figure 5. The effects of miR-625-3p on the CRC cell apoptosis.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

图5 miR-625-3p对结肠癌细胞凋亡的影响

7 miR-625-3p对结肠癌细胞Bcl-2/Bax蛋白的影响

用Western blot法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达,结果表明，Bax在SW480细胞中高表达，转染miR-625-3p后，Bax表达量没有显著变化；在SW620细胞中转染anti-miR-625-3p后Bax表达量显著升高(P<0.05)。Bcl-2在SW480细胞中转染anti-miR-625-3p后，Bcl-2的表达量显著增加；Bcl-2在SW620细胞中转染anti-miR-625-3p后Bax的表达量显著降低(P<0.05)，见图6。

讨 论

结肠癌在我国发病率较高，最新报道的统计资料表明我国仅在2015年结肠癌新发病例达到37.6万，死亡人数达到19.1万人，在所有肿瘤中排第5位[9]。目前在结肠癌的诊治方面取得了重要的进展，患者的预后主要取决于结肠癌的进展，因此，研究结肠癌发生发展的机制和探索治疗的新靶点成为目前研究的重点和热点。最近的研究发现miRNAs家族中miR-625-3p与包括结肠癌在内的肿瘤发生发展可能有关。

本实验结果表明miR-625-3p在结肠癌组织和癌旁组织中的表达差异有统计学显著性，在结肠癌组织中的表达远远高于癌旁组织，通过进一步分析miR-625-3p与结肠癌临床特征的关系，发现miR-625-3p的相对表达量与肿瘤浸润深度、TNM分期和远处转移有关系。这些结果表明miR-625-3p在结肠癌组织与癌旁组织之间表达存在差异，提示miR-625-3p与结肠癌的病理生理有关，在一定程度上也可能是促进结肠癌细胞增殖、侵袭转移的因素。既往文献报道[10]miR-625-3p能够增强肝癌细胞的侵袭转移，而我们的实验在结肠癌组织中也发现了类似的结果，进一步说明miR-625-3p参与了结肠癌的发生发展。如同在肝癌中所起作用一样，miR-625-3p可能扮演着癌基因的作用，具有促进肿瘤细胞增殖、分化、侵袭的功能[7-8]。进一步在细胞实验的验证中，我们采用了具有同一遗传背景的2种侵袭转移潜能不同的细胞：来源于结肠癌原发部位的肿瘤细胞系SW480细胞，和来源于同一结肠癌患者的转移淋巴结肿瘤细胞系SW620细胞[11]，因来源于同一患者，具有相同的遗传背景，因此实验结果更具有可比性。实验结果表明miR-625-3p在转移性结肠癌SW620细胞中的表达高于来源于结肠癌原发部位的SW480细胞中的表达，这表明miR-625-3p的表达不仅与结肠癌细胞的增殖有关，而且与侵袭转移能力相关。

Figure 6.The effects of miR-625-3p on the protein exprossion of Bcl-2 and Bax in the CRC cell lines. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC;#P<0.05vsanti-NC.

图6 miR-625-3p对结肠癌细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响

肿瘤细胞的特征不仅表现为侵袭转移，而且癌细胞一般具有潜力无限的复制能力，细胞周期是细胞保持正常生命活动的基本过程，而肿瘤的细胞周期会发生异常，其与正常细胞显著不同的是具有无限增殖潜能，导致肿瘤一系列症状的发生，因此阻滞肿瘤细胞周期能有效地发挥抗肿瘤作用。在细胞周期中存在一些细胞周期调控位点，如G1-S调控点、S-G2/M 期调控点等，这些检测点能调控细胞各周期之间的转换，当细胞周期转换受到外界干扰就有可能被阻滞在某一检测点之前，形成周期阻滞，从而导致细胞停止增殖发育。影响细胞周期的因素很多，既往有文献报道microRNA能够对细胞周期发挥影响[12]。本研究证实转染miR-625-3p抑制剂后处于G0/G1期细胞比例升高，G2/M期细胞比例降低。当处于 G0/G1细胞越多，S 期细胞越少时，细胞的增殖速度就会越低，这也是很多其它抗肿瘤药物产生抑制肿瘤细胞增殖的机制之一。结合既往文献报道[8]及相关的结肠癌与miRNAs的关系，可以推测在结肠癌细胞的增殖中miR-625-3p具有重要的影响，其抑制后可能会对肿瘤细胞周期发挥阻滞作用。这可能从反面证实miR-625-3p对细胞周期的转换具有促进作用，能够促进肿瘤细胞的增殖。在研究miR-625-3p对结肠癌细胞增殖影响的实验中，发现miR-625-3p直接促进了结肠癌细胞的增殖。

目前对miR-625-3p如何促进结肠癌细胞的增殖和侵袭转移的机制仍不明确，miR-625-3p可能对结肠癌细胞的某些基因发挥了影响。为探讨miR-625-3p对结肠癌细胞中癌基因及抑癌基因表达的影响，在细胞中转染了miR-625-3p拟似物和抑制剂，实验结果表明miR-625-3p能促进细胞凋亡，进一步实验研究结果显示miR-625-3p能够促进Bcl-2的表达，miR-625-3p抑制剂能够抑制Bax的表达。Bcl-2是抗凋亡蛋白，在结肠癌细胞中高表达，调控结肠癌细胞的增殖和发生发展，其对应的促凋亡蛋白Bax能够通过细胞色素C途径激活caspases 家族，导致结肠癌细胞发生凋亡[13-14]。miR-625-3p通过哪种途径对结肠癌细胞中Bcl-2/Bax发挥调控作用，还有待进一步的研究。

总之，本研究从临床结肠癌标本和细胞中均证实了miR-625-3p对结肠癌的发生发展(如增殖、凋亡、侵袭转移方面)发挥了重要作用，并调控了结肠癌细胞中Bcl-2/Bax的表达，这也证实miR-625-3p可能是结肠癌新的抗癌靶点，为以后进一步研究打下了基础。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Expression of miR-625-3p in colorectal carcinoma tissues and cells

ZHENG Hai-lun, ZHAO Rui, LI Da-peng, WANG Qiang-wu, WANG Jian-chao, WANG Qi-zhi

(DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China.E-mail: 329565877@qq.com)

AIM: To investigate the expression of microRNA-625-3p (miR-625-3p) in colorectal carcinoma (CRC) and its underlying mechanism. METHODS: Quantitative real-time PCR was employed to detect the levels of miR-625-3p expression in different CRC cell lines, CRC tissues and pair-matched adjacent normal tissues. The relationships between the expression levels of miR-625-3p and the patients’ clinicopathological parameters were estimated. The effects of miR-625-3p on the apoptosis and the cell mitotic cycle of CRC cells were analyzed with propidium iodide staining and flow cytometry. The effect of miR-625-3p on the apoptosis-related proteins was analyzed by Western blot. RESULTS: The expression level of miR-625-3p in the CRC tissues was higher than that in the pair-matched adjacent normal tissues (P<0.05). The expression of miR-625-3p in the CRC tumor tissues was significantly correlated with the tumor infiltrative depth, TNM stage and distant metastasis (P<0.05). The expression levels of miR-625-3p in CRC SW620 cells were higher than that in SW480 cells. The CRC cell mitotic cycle was significantly inhibited and cell apoptosis was significantly promoted when the expression of miR-625-3p was inhibited (P<0.05). The expression of Bax protein didn’t change and the expression of Bcl-2 protein increased after miR-625-3p mimics were transfected into CRC SW620 cells(P<0.05). CONCLUSION: miR-625-3p may be a promising approach for the treatment of CRC by promoting cell proliferation and inhibiting apoptosis.

Colorectal carcinoma; MicroRNA-625-3p; Cell cycle; Apoptosis

1000- 4718(2016)08- 1376- 07

2016- 04- 11

2016- 06- 27

国家自然科学基金资助项目(No. 81372899)；安徽省高等学校自然科学研究项目(No. KJ2015A177)

R574.62； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.08.006

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0552-3086125; E-mail: 329565877@qq.com