丹参注射液对氧诱导幼鼠视网膜增生变性的保护作用

曹美玲，吴红敏

(中国医科大学附属第一医院，辽宁 沈阳 110001)



丹参注射液对氧诱导幼鼠视网膜增生变性的保护作用

曹美玲，吴红敏

(中国医科大学附属第一医院，辽宁 沈阳 110001)

[摘要]目的探讨丹参注射液对氧诱导幼鼠视网膜凋亡相关基因的表达及其外周血血管内皮生长因子(VEGF)的影响，以明确其抑制视网膜增生变性的作用机制。方法将100只出生7 d的SD幼鼠随机分为对照组、模型组及丹参注射液4，2，1 g/kg组，每组20只。对照组幼鼠生活在正常氧环境下，其余4组幼鼠均制成视网膜病变模型。模型组给予腹腔注射生理盐水，丹参注射液4，2，1 g/kg组分别给予腹腔注射相应剂量的丹参注射液，连续注射5 d后处死幼鼠，经右侧眼球取静脉血检测VEGF浓度，取出眼球用RT-PCR法检测视网膜中bax与bcl-2 mRNA表达水平。结果模型组幼鼠视网膜组织中bax mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05)，而血清VEGF浓度与视网膜组织中bcl-2 mRNA表达水平均明显高于对照组(P均<0.05)。丹参注射液2 g/kg组血清VEGF浓度及视网膜组织中bcl-2 mRNA表达水平均明显低于丹参注射液1 g/kg组(P均<0.05)，高于丹参注射液4 g/kg 组(P均<0.05)；视网膜组织中bax mRNA表达水平明显高于丹参注射液1 g/kg组(P<0.05)，低于丹参注射液4 g/kg组(P<0.05)。bax mRNA表达水平与bcl-2 mRNA表达水平间存在显著负相关关系(r=-0.653，P<0.05)。结论丹参注射液能抑制氧诱导的幼鼠视网膜细胞增生。

[关键词]早产儿视网膜病变；丹参注射液；血管内皮生长因子；凋亡

早产儿视网膜病变(ROP)的发病率有逐年上升的趋势，尽管近年来在诊断和治疗上有明显进步，但是视网膜病变仍是主要致盲原因之一[1]。为有效治疗视网膜病变，降低其发病率，揭示该病的发生机制成为目前迫切需要解决的问题。丹参注射液具有捕获游离基、改善微循环、抑制细胞凋亡等功效，是一种抗氧化剂[2]，但是其对氧诱导视网膜增生抑制作用尚不明确。故本研究以SD幼鼠进行氧诱导视网膜病变模型的建立，探讨丹参注射液对氧诱导幼鼠视网膜凋亡相关基因的表达及其外周血血管内皮生长因子(VEGF)的影响，以明确其抑制视网膜增生变性的作用机制。现将结果报道如下。

1实验资料

1.1实验动物100只出生7 d SD幼鼠由军事医学科学院实验动物中心提供，动物合格证号：0034309。

1.2主要试剂丹参注射液为广东永康药业有限公司提供，规格：0.1 g/mL，批号：140231B；外周血清VEGF 浓度ELISA检测试剂盒为Sigma公司产品；RT-PCR试剂盒为日本TaKaRa公司产品；Trizol试剂为美国Introgen公司产品。

1.3主要仪器ASD-310S型低温离心机为美国Sigma公司产品；PCR仪为德国Biometra公司产品。

1.4方法

1.4.1实验动物分组及处理将100只出生7 d的SD幼鼠随机分为对照组、模型组及丹参注射液4，2，1 g/kg 组，每组20只。所有幼鼠均由母鼠喂养，人工控温21～25 ℃，12 h光照，12 h黑暗。对照组幼鼠生活在正常氧环境下，其余4组幼鼠均参照文献[3]方法制成视网膜病变模型：幼鼠于生后与同笼的2只母鼠一起装入有机玻璃制作的密闭氧箱(一端设计为进气孔，另一端设计为出气孔)饲养，先将玻璃容器内气体抽出成为真空状态，然后接入湿润医用纯氧气(1.5 L/min)，氧分压保持在75%，每2 d打开玻璃容器更换垫料加食、换水并替换母鼠。在高氧环境中饲养5 d(至出生12 d)后返回正常空气中饲养5 d(至出生17 d)，模型组出笼后给予腹腔注射生理盐水，丹参注射液4，2，1 g/kg组分别给予腹腔注射相应剂量的丹参注射液，均连续腹腔注射5 d(至出生17 d)。

1.4.3VEGF浓度测定经右侧眼球取静脉血用酶联免疫法(ELISA)测定VEGF浓度，所取标本均在1 周内测定。

2结果

2.1视网膜组织中bax、bcl-2 mRNA表达水平模型组幼鼠视网膜组织中bax mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05)，bcl-2 mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)。丹参注射液2 g/kg 组视网膜组织中bcl-2 mRNA表达水平明显低于丹参注射液1 g/kg 组(P<0.05)，但高于丹参注射液4 g/kg 组(P<0.05)；视网膜组织中bax mRNA表达水平明显高于丹参注射液1 g/kg 组(P<0.05)，但低于丹参注射液4 g/kg 组(P<0.05)。bax mRNA表达水平与bcl-2 mRNA表达水平间存在显著负相关关系(r=-0.653，P<0.05)。见表1。

表1　各组视网膜组织中bax、bcl-2 mRNA

注：①与对照组比较,P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与丹参注射液4 g/kg 组比较，P<0.05；④与丹参注射液2 g/kg 组比较，P<0.05。

2.2VEGF浓度检测结果对照组VEGF浓度为(44.67±5.78)nmol/mL，模型组为(66.78±8.31)nmol/mL，丹参注射液4 g/kg组为(53.53±5.43)nmol/mL ，丹参注射液2 g/kg组为(57.34±6.43)nmol/mL，丹参注射液1 g/kg组为(61.45±7.65)nmol/mL。模型组血清VEGF浓度明显高于对照组(P<0.05)；丹参注射液各组血清VEGF浓度均明显低于模型组(P均<0.05)；丹参注射液4 g/kg组和丹参注射液2 g/kg组血清VEGF浓度均明显低于丹参注射液1 g/kg组(P<0.05)，且丹参注射液4 g/kg组明显低于丹参注射液2 g/kg组(P<0.05)。

3讨论

早产儿视网膜病变是指发生于早产儿的以视网膜血管异常增生为特征的视网膜血管疾病，而视网膜缺氧可诱导视网膜产生血管生成因子，进而刺激新生血管形成，临床上常用ACEI类药物来抑制其生成[4]。VEGF是连接新生血管形成各个网络的枢纽，其与bcl-2可以相互调节促进新生血管形成[5]。bax基因本身发挥促进凋亡的效应需要与其家族中bcl-2基因相互协调形成一个调控体系，当bax同源二聚体形成时诱导细胞凋亡，而bcl-2蛋白表达量升高时，bax二聚体逐渐分开，与bcl-2蛋白形成更稳定的bax-bcl-2异源二聚体，从而抑制细胞凋亡[6]。

丹参具有抑制细胞凋亡、抗脂质过氧化和清除自由基作用，且是一种强抗氧化剂，能升高血清SOD与GSH-PX活性，并降低过氧化物活性，其可能通过打破氧自由基介导的细胞损伤，抑制脂质过氧化物与自由基生成，保护细胞膜的稳定性而达到保护细胞作用[7-9]。

氧诱导视网膜病变模型是视网膜病变和其他异常视网膜血管增生性疾病的主要模型之一，其主要依据生后第7 天小鼠的视网膜血管发育最接近早产儿视网膜血管的特点，将这种小鼠置于高氧环境中，小鼠的视网膜可出现血管增生等类似人类视网膜病变的改变而建立[3]。本实验结果显示，模型组幼鼠视网膜组织中bax mRNA表达水平明显低于对照组，而血清VEGF浓度与视网膜组织中bcl-2 mRNA表达水平均明显高于对照组。丹参注射液2 g/kg组血清VEGF浓度及视网膜组织中bcl-2 mRNA表达水平均明显低于丹参注射液1 g/kg组，高于丹参注射液4 g/kg组；视网膜组织中bax mRNA表达水平明显高于丹参注射液1 g/kg组，低于丹参注射液4 g/kg组；bax mRNA表达水平与bcl-2 mRNA表达水平间存在显著负相关关系。

综上所述，丹参注射液能抑制氧诱导的幼鼠视网膜细胞增生，对视网膜病变等视网膜新生血管疾病的治疗可能具有潜在的应用前景，为视网膜新生血管疾病的治疗提供了一个新的思路，但目前对其确切的作用机制还不明了，有待进一步研究。

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Protecting effect of Danshen injection on the oxygen-induced retinopathy in neonatal rats

CAO Meiling,WU Hongmin

(The First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110001,Liaoning, China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of Danshen injection on the expression of apoptosis correlated gene and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the serum in the neonatal rats with oxygen induced retinopathy,and to research the mechanism of inhibiting hyperplasia.Methods 100 neonatal rats (7-day old) were randomly divided into five groups: control group,model group, Danshen injection groups(4, 2,1 g/kg),every group included 20 rats. The rats in control group lived in the environment with normal oxygen.The rats in other groups were used to establish models of retinopathy of prematurity. Model group was given normal saline, Danshen injection groups were given 4, 2, 1 g/kg Danshen injection respectively. After intervention for 5 days, the rats were killed to draw their blood to detect the concentration of VEGF, and to get their retina to determine the expression levels of bax and bcl-2 through RT-PCR. Results The level of bax mRNA in retina tissue in model group was lower while that of bcl-mRNA was higher than that in control group(P<0.05). The content of serum VEGF and the expression of bcl-2 mRNA in 2 g/kg Danshen injection group were lower than that in 1 g/kg Danshen group (P<0.05), but higher than that in 4 g/kg Danshen injection group (P<0.05). The expression of bax mRNA in retina tissue in 2 g/kg Danshen injection group were higher than that in 1 g/kg Danshen group (P<0.05), but lower than that in 4 g/kg Danshen injection group (P<0.05). Bax mRNA expression was negatively related with bcl-2 mRNA (r=-0.653,P<0.05). Conclusion Ginkgo biloba extract can inhibit the hyperplasia induced by oxygen.

Key words:retinopathy of prematurity; Danshen injection; vascular endothelial growth factor; apoptosis

[收稿日期]2015-12-16

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)11-1174-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.010

[作者简介]曹美玲，女，硕士，主治医师，主要从事新生儿疾病方面的研究。[通信作者]吴红敏，E-mail：whm406@163.com