SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF在子宫内膜异位症组织中的表达及意义

张　敏,宋殿荣，曹保利，刘　帅，刘晋津

(1. 天津中医药大学，天津 300100；2. 天津市南开医院，天津 300100；3. 天津中医药大学第二附属医院，天津 300000)



SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF在子宫内膜异位症组织中的表达及意义

张敏1,2,宋殿荣3，曹保利2，刘帅1，刘晋津2

(1. 天津中医药大学，天津 300100；2. 天津市南开医院，天津 300100；3. 天津中医药大学第二附属医院，天津 300000)

[摘要]目的探讨基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、趋化因子受体-4(CXCR4)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)在子宫内膜异位症患者子宫内膜组织中的表达情况及意义。方法取50例子宫肌瘤患者正常子宫内膜组织标本作为正常组，50例子宫内膜异位症患者在位内膜组织和异位内膜组织标本分别作为在位组和异位组。采用免疫组化法及PCR技术检测SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在各组的表达情况。结果SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在子宫内膜异位症患者异位内膜组织、在位内膜组织及正常子宫内膜组织腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，以腺上皮表达为著。异位组SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF平均光密度值和SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表达量均明显高于在位组和正常组(P均<0.05)，而在位组高于正常组(P均<0.05)。结论SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF的高表达与子宫内膜异位症发病相关，推测SDF-1、CXCR4高表达可能直接或通过其他相关通路影响MMP-9及VEGF的表达而参与子宫内膜异位症的侵袭和血管形成过程，为子宫内膜异位症的发病机制及诊治提供了更深入的靶点。

[关键词]子宫内膜异位症；基质细胞衍生因子；趋化因子受体-4；基质金属蛋白酶-9；血管内皮生长因子

子宫内膜异位症(EMs)是育龄妇女的常见病、多发病, 其发病机制研究众说纷纭，而不管哪种学说，黏附—侵袭—血管生成都是其基本病理过程，但能促进异位子宫内膜黏附、侵袭和血管生成的确切机制尚不清楚。该病虽为良性疾病, 但具有与恶性肿瘤相似的侵袭性[1]。基质细胞衍生因-1(SDF-1)、趋化因子受体-4(CXCR4)是近年来研究较多的与肿瘤发病相关的因子，两者特异性结合后形成的SDF-1/CXCR4在肿瘤细胞的迁移、侵袭、增殖及血管形成过程中发挥重要的生物学作用[2-3]。本研究以免疫组化法、PCR法检测了SDF-1、CXCR4、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子(VEGF)在子宫内膜异位症患者在位内膜和异位内膜组织中的表达情况，旨在探讨各指标与子宫内膜异位症发生的关系及意义。

1研究资料

1.1一般资料收集2014年9月—2015年9月在天津市南开医院妇产科因腺肌症合并内异症接受子宫切除术的50例患者在位内膜和异位内膜组织标本各50份分别作为在位组和异位组，另选择同期因子宫肌瘤手术的 50 例正常子宫内膜组织标本作为正常组。所有患者均无内科合并症，术前3个月内未服用激素类药物。所有标本获得均经医院伦理委员会批准并取得患者知情同意,并均经腹腔镜或开腹手术及组织病理证实,均有完整的临床及病理资料。

1.2研究方法

1.2.1免疫组化法检测SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF在各组织标本中表达情况标本经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚度连续切片后脱蜡;配制PBS浸泡5 min；热抗原修复(pH值6.0)；3%过氧化氢去离子水孵育10 min以消除内源性过氧化酶活性；滴加山羊血清工作液封闭，室温孵育15 min；分别滴加1∶100比例稀释的SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF一抗，4 ℃孵育过夜;加入相应的二抗，37 ℃孵育15 min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液37 ℃孵育15 min；DAB 显色，苏木素复染、脱水、透明、封片。每步均经PBS洗涤3次，每次5 min。免疫组化染色采用S-P法，操作具体步骤按试剂盒说明书进行。山羊抗人SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF试剂盒均由北京博奥森生物技术有限公司提供。采用Image-ProPlus 6.0图像分析系统对SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF免疫组化切片进行图像分析处理，以胞浆见棕黄色颗粒为阳性染色细胞。采用彩色自动图像分析软件对染色结果进行分析，每张切片保持光线强度不变，低倍镜下先选取异位病灶区，高倍视野(×400)输入计算机进行分析，以平均光密度值作为SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF的相对表达强度，每张切片随机观察5个视野，然后取平均值作为每张切片的观察结果。

1.2.2RT-PCR方法检测SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA及VEGF mRNA在各组织标本中表达水平引物设计： SDF-1上游序列为5’-CCATGAACGCCAAGGTCGTGGTC-3’,下游序列为5’-AGGGCATGGATGAATATA-3’；CXCR4上游序列为5’-AGGTGGTCTATGTTGGCGTCTGGAT-3’,下游序列为5-AGGATGGGGATGATTGTGGTCTTGA-3’；MMP-9上游序列为5’-GGTGGACCGGATGTTCCC-3’,下游序列为5’-GCCCACCTCCACTCCTCC-3’；VEGF上游序列为5’-TCGGGCCTCCGAAACCATGA-3’,下游序列为： 5’-CCTGGTGAGAGATCTGGTTC-3’；内参对照物β-actin上游序列为5’-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3’,下游序列为5’-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3’。用TRIzol抽提组织总RNA，逆转录，PCR扩增SDF-1、CXCR4、MMP-9及VEGF，并扩增β-actin作为内参物，逆转录试剂盒和RNA提取试剂购自天津生化科技北京有限公司。β-actin和SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF引物以及荧光定量PCR试剂盒购于天津生化科技北京有限公司。反应条件： 94 ℃预变性2 min,1个循环;94 ℃变性20 s,35个循环；SDF-1,CXCR4,MMP-9及VEGF、内参β-actin分别55 ℃退火30 s，20 s,35个循环；68 ℃延伸1 min,共35个循环。

2结果

2.1免疫组化结果SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在子宫内膜异位症患者异位内膜组织、在位内膜组织及正常子宫内膜组织腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，以腺上皮表达为著，且阳性部位定位于细胞浆。异位组SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF平均光密度值均明显高于在位组和正常组(P均<0.05)，而在位组高于正常组(P均<0.05)。3组各指标表达情况见图1～12及表1。

图1　异位内膜中SDF-1表达情况(×400)

图2　在位内膜中SDF-1表达情况(×400)

2.2PCR检测结果异位组SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA 表达量均明显高于在位组和正常组(P均<0.05)，而在位组高于正常组(P均<0.05)。见表2。

3讨论

SDF-1/CXCR4是近年来研究较多的与肿瘤发病相关的因子。SDF-1是CXC趋化因子亚家族的成员之一，CXCR4是SDF-1的特异性受体，二者特异性结合后形成的SDF-1/CXCR4具有增加肿瘤细胞与细胞外基质、基底膜等黏附、侵袭的作用[4]，是肿瘤发生转移及形成的先决条件。研究表明，SDF-1与CXCR4 的相互作用激活了G蛋白,从而激活了 磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(PI3-K/Akt)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、转录因子(NF-κB)，即通过CXCL12/CXCR4-PI3K-MAPK-NF-κB通路进行信号转导[5]，进而促进肿瘤细胞高表达基质金属蛋白酶(MMPs)等而提高肿瘤的侵袭能力[6]；且SDF-1与CXCR4的结合可以通过激活PI3K/AKT信号传导途径诱导VEGF的生成[7]，而VEGF与肿瘤细胞生长和转移密切相关。应用RNA技术敲除CXCR4基因后的CXCR4拮抗剂AMD3100，不仅在体外减少了VEGF的生成，而且在体内也抑制了小鼠中转移瘤的增殖生长及血管的形成[8-9]。说明SDF-1/CXCR4在肿瘤组织的侵袭和血管形成中担着重要角色，其调节MMP-9及VEGF高表达而致病。

图3　正常内膜中SDF-1表达情况(×400)

图4　异位内膜中CXCR4表达情况(×400)

图5　在位内膜中CXCR4表达情况(×400)

图6　正常内膜中CXCR4表达情况(×400)

图7　异位内膜中MMP-9表达情况(×400)

图8　在位内膜中MMP-9表达情况(×400)

图9　正常内膜中MMP-9表达情况(×400)

图10　异位内膜中VEGF表达情况(×400)

图11　在位内膜中VEGF表达情况(×400)

图12　正常内膜中VEGF表达情况(×400)

组别nSDF-1CXCR4MMP-9VEGF异位组500.1923±0.04320.1730±0.09310.1594±0.09560.1382±0.0068在位组500.1411±0.0142①②0.1205±0.0029①②0.1220±0.0693①②0.0814±0.0239①②正常组500.0350±0.0537①0.0462±0.0040①0.0462±0.0106①0.0481±0.0089①

注：①与异位组比较,P<0.05；②与正常组比较,P<0.05。

表2　3组SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表达量比较

注：①与异位组比较,P<0.05；②与正常组比较,P<0.05。

子宫内膜异位症的生物学特性与恶性肿瘤很相似，故本研究检测了上述指标，以探讨其发病机制。结果表明SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF在子宫内膜异位症患者异位内膜组织、在位内膜组织及正常子宫内膜组织腺上皮细胞和间质细胞中均有表达，以腺上皮表达为著；异位组SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF平均光密度值和SDF-1 mRNA、CXCR4 mRNA、MMP-9 mRNA、VEGF mRNA 表达量均明显高于在位组和正常组，而在位组高于正常组。说明SDF-1、CXCR4、MMP-9、VEGF的高表达与子宫内膜异位症的发病有关，推测SDF-1、CXCR4高表达可能直接或通过其他相关通路影响MMP-9及VEGF的表达而参与子宫内膜异位症的侵袭和血管形成过程，为子宫内膜异位症的发病机制及诊治提供了更深入的靶点。而SDF-1/CXCR4与MMP-9、VEGF之间相关性及调节机制仍不清楚，有待进一步研究。

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Expression and significance of SDF-1， CXCR4, MMP-9 and VEGF in human endometriosis

ZHANG Min1,2, SONG Dianrong3, CAO Baoli2，LIU Shuai1, LIU Jinjin2

(Tianjin University of TCM, Tianjin 300100, China; 2.Nankai Hospital of Tianjin, Tianjin 300100, China; 3.The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM, Tianjin 300000, China)

Abstract:Objective It is to discuss the expression and significance of stromal cell derived by SDF-1 (SDF-1), chemokine receptors-4 (CXCR4), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), vascular endothelial growth factor (VEGF) in endometriosis patients. Methods The normal endometrial tissue samples of 50 patients with uterine fibroids were selected as normal group,and eutopic and ectopic endometrial tissue samples of 50 cases with endometrium were used as eutopic and ectopic group respectively. The expression of SDF-1, CXCR4, MMP-9, VEGF in each group was detected by immunohistochemistry and PCR technology. Results SDF-1, CXCR4, MMP-9, VEGF were expressed in ectopic endometrium tissue, ectopic tissue, normal endometrial glandular epithelial cells and stromal cells in patients with endometriosis, and in glandular epithelium the expression was more obviously. Average optical density of ectopic group SDF-1, CXCR4, MMP-9, VEGF and SDF-1 mRNA, CXCR4 mRNA, MMP-9 mRNA, VEGF mRNA expression were significantly higher than those in eutopic and normal group (P<0.05), while the indexes in eutopic group were higher than that in normal group (P<0.05). Conclusion High expression of SDF-1 and CXCR4, MMP-9, VEGF is associated with endometriosis pathogenesis, and we speculated that high expression of SDF-1, CXCR4 may directly or indirectly influence the expression of MMP-9 and VEGF through other relevant pathways, thus participate in endometriosis invasion and angiogenesis, for providing a more in-depth targets in endometriosis pathogenesis, diagnosis and treatment.

Key words:endometriosis；SDF-1；CXCR4；MMP-9；VEGF

[收稿日期]2015-11-30

[中图分类号]R711.71

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)11-1147-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.002

[基金项目]天津市卫生和计划生育委员会中医中西医结合科研课题(2015053)

[作者简介]张敏，女，主治医师，硕士，研究方向为子宫内膜异位症的发病机制及中西医结合诊治。