清热活血方对溃疡性结肠炎模型小鼠β-catenin、Cdx1、Cdx2表达影响的研究

李华燕，李　斌，黄建斌，陈　玉，张　涛

(1. 广东省江门市第二人民医院，广东 江门 529050；2. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011)



论著

清热活血方对溃疡性结肠炎模型小鼠β-catenin、Cdx1、Cdx2表达影响的研究

李华燕1，李斌1，黄建斌1，陈玉2，张涛2

(1. 广东省江门市第二人民医院，广东 江门 529050；2. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011)

[摘要]目的观察清热活血方对溃疡性结肠炎模型小鼠结肠黏膜组织中β-catenin、Cdx1、Cdx2表达的影响，探讨该方防治溃疡性结肠炎的可能机制及其效应靶点。方法将100只雄性Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、清热活血方低剂量组、清热活血方中剂量组及清热活血方高剂量组，除正常组外，其余组采用自由饮用3%DSS 2周法制备溃疡性结肠炎模型。自第3周起，正常组、模型组给予等剂量生理盐水，各给药组分别给予清热活血方3.3 g/kg、6.6 g/kg、13.2 g/kg灌胃，均连续1周。末次给药后处死全部小鼠，应用HE染色法检测结肠黏膜组织病理学变化；应用免疫组化及荧光定量PCR技术检测结肠黏膜组织中β-catenin、Cdx1、Cdx2表达情况；应用免疫荧光染色法检测结肠黏膜组织中β-catenin核内转位变化。结果光镜下可见模型组结肠黏膜上皮脱落，大量炎性细胞浸润及溃疡形成；而各给药组结肠黏膜充血、肿胀、上皮细胞脱落及成纤维母细胞表达增加，黏膜固有层可见少许炎性细胞浸润，未见明显溃疡。与正常组比较，模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2表达明显增加(P均<0.05)；与模型组比较，各给药组β-catenin、Cdx1、Cdx2阳性表达明显减少(P均<0.05)。模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin存在膜表达缺失、核内异常转位现象，而各给药组小鼠结肠黏膜中β-catenin表达以细胞膜为主，核内表达减少，部分可见核内异常转位。结论清热活血方可能通过促进β-catenin降解，下调Cdx1、Cdx2表达，调控肠上皮细胞增殖，修复肠黏膜屏障而发挥缓解溃疡性结肠炎的效用。

[关键词]β-catenin信号；溃疡性结肠炎；清热活血方；Cdx1；Cdx2

生理情况下，结肠细胞凋亡主要发生在肠腔上皮细胞，而活动期溃疡性结肠炎患者，除肠腔上皮细胞外，病变处及邻近的非病变处隐窝上皮细胞的凋亡增加，从而使由上皮细胞构成的黏膜屏障破坏，导致了结肠黏膜的损伤、溃疡甚至癌变。目前越来越多的证据提示[1]，结肠上皮细胞的凋亡异常是导致溃疡性结肠炎结肠组织损伤和免疫紊乱的重要机制之一。课题组前期研究亦发现，肠上皮细胞凋亡加速和炎性细胞凋亡延缓导致肠黏膜屏障完整性破坏，炎症持续在溃疡性结肠炎发生、发展中占据重要地位[2-3]。在“湿热毒瘀”贯穿疾病始终的前提下，应用清热活血类方药干预溃疡性结肠炎研究证实，该方具有明确缓解溃疡性结肠炎、促进黏膜愈合质量的效用[4]，但是关于其具体作用靶点尚未明确，由此课题组在中医药理论指导下，基于现代医学研究进展，拟从β-catenin信号介导Cdx1、Cdx2表达参与肠上皮细胞修复角度，探讨健脾清热活血类方药干预溃疡性结肠炎的可能靶点。

1实验资料

1.1实验动物4周龄雄性Balb/c小鼠100只，体质量(18±2)g，购自湖南斯莱克实验动物中心，动物许可证号：SCXK(湘)2011-0003，动物合格证号：4304701479。

1.2试剂与仪器葡聚糖硫酸钠(DSS，货号D8903)购自Sigma，Cdx1、Cdx2、β-catenin一抗购自美国SanTa，二抗购自博士德生物公司，无水乙醇、甲醛、戊二醛、生理盐水等购自广东国药控股，ABI7500荧光定量PCR仪，Bio-Rad全自动酶标仪以及倒置相差显微镜(蔡司)，Cdx1、Cdx2、β-catenin引物合成由上海生工生物技术有限公司完成。

1.3实验药物清热活血方由白术10 g、炙甘草6 g、马齿苋15 g、白芍15 g、土鳖虫10 g、三七10 g组成，专人对组成药味进行产地确证、品种鉴定、品质评价，确保药材质量规范化。用蒸馏水煎成中药药液，浓缩配制成1 g原生药/1 mL的药液，过滤除菌分装4 ℃保存备用。

1.4实验方法

1.4.1造模及分组给药将100只雄性Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、清热活血方低剂量组、清热活血方中剂量组及清热活血方高剂量组，每组20只。参照文献[5-6]，全部小鼠适应性喂养1周，除正常组同步饲养外，其余组采用自由饮用3%DSS 2周法制备溃疡性结肠炎模型。自第3周起，正常组、模型组给予等剂量生理盐水，各给药组分别给予清热活血方3.3 g/kg、6.6 g/kg、13.2 g/kg灌胃(按人与小鼠体质量折算)，均连续1周。

1.4.2指标检测末次给药后2 h，处死全部小鼠，剪取从回盲部至直肠全部肠段，分别置于甲醛、电镜固定液及液氮中备测。①采用HE染色法，检测结肠黏膜组织病理学变化，具体实验步骤按说明进行。 ②采用免疫组化SABC法检测小鼠结肠黏膜组织中β-catenin、Cdx1、Cdx2蛋白表达情况，具体实验步骤严格按照试剂盒说明进行，由2名病理科医生进行盲评分析，分析软件为Image pro plus 9.0。③应用Real-time PCR技术检测β-catenin、Cdx1、Cdx2 mRNA表达变化，具体步骤按试剂盒说明操作。在GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS区设计特异性引物。β-catenin引物序列：上游为5’-CTCTGGGGCTGGCTGTAGAC -3’，下游为5’-ACATCTCCTCCGGACTCTTCC -3’， 扩增长度169 bp；Cdx1引物序列：上游为5’-ACGCTGACGAAAGTGTTGGT-3’，下游为5’-TCTGGGTTTTCCGGGGTAGC -3’， 扩增长度107 bp；Cdx2引物序列：上游为5’-CCTGGATGCTGGAGGTCTGT -3’，下游为5’-CGGCTCTTCTTCAAGGGCTC -3’， 扩增长度128 bp； GAPDH引物序列：上游为5’-GTTGTCTCCTGCGACTTCA -3’，下游为5’-GCCCCTCCTGTTATTATGG -3’， 扩增长度93 bp。④采用免疫荧光显微镜检测小鼠结肠黏膜中β-catenin核内转位变化，具体实验委托广州达安基因生物有限公司完成。

2结果

2.1小鼠结肠黏膜组织病理学表现正常组小鼠结肠黏膜下层轻度血管扩张，少量炎细胞浸润，结肠壁各层结构均正常；模型组小鼠结肠壁黏膜面见巨大溃疡，肠壁各层充血、水肿，大量炎细胞浸润；各给药组小鼠结肠黏膜病理变化无明显差异，均见结肠壁黏膜及黏膜下层轻度充血水肿，少量炎细胞浸润及成纤维母细胞增加。见图1～5。

图1　正常组小鼠结肠黏膜组织病理学表现(×20)

2.2小鼠结肠黏膜组织中β-catenin、Cdx1、Cdx2蛋白表达情况与正常组比较，模型组小鼠结肠黏膜组织中β-cate-nin、Cdx1、Cdx2阳性表达明显增加(P均<0.05)；与模型组比较，各给药组β-catenin、Cdx1、Cdx2阳性表达明显减少(P均<0.05)。见图6～20及表1。

图2　模型组小鼠结肠黏膜组织病理学表现(×20)

图3　清热活血方低剂量组小鼠结肠黏膜组织病理学表现(×20)

图4　清热活血方中剂量组小鼠结肠黏膜组织病理学表现(×20)

图5　清热活血方高剂量组小鼠结肠黏膜组织病理学表现(×20)

2.3小鼠结肠黏膜中β-catenin 、Cdx1、Cdx2 mRNA表达情况与正常组比较，模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2 mRNA表达明显增加(P均<0.05)；与模型组比较，各给药组β-catenin、Cdx1、Cdx2 mRNA表达明显减少(P均<0.05)。见表2。

2.4小鼠结肠黏膜中β-catenin核内转位情况模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin存在膜表达缺失、核内异常转位现象；而各给药组小鼠结肠黏膜中β-catenin表达以细胞膜为主，核内表达减少，部分可见核内异常转位。见图21～25。

图6　正常组小鼠结肠黏膜中β-catenin蛋白表达情况(×10)

图7　模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin蛋白表达情况(×10)

图9　清热活血方中剂量组小鼠结肠黏膜中β-catenin蛋白

3讨论

中医学按症状将溃疡性结肠炎归属于“久痢” “休息痢”范畴，本课题组结合临床实践，在中医学指导下认为“湿热毒瘀”是溃疡性结肠炎发生的内在本质，湿热内盛，聚湿成痰，痰随气而升无处不至，日久阻塞经络，化为瘀血，痰瘀互结，损伤肠络，“初病在经，久病入络”，此之谓也。气血阻滞肠络，局部则为黏膜循环障碍，缺氧、缺血，肠黏膜屏障功能低下，食物抗原及内生抗原更易侵入，造成肠上皮细胞损伤，不断修复，重构异常，以致炎症反复发作。故根据上述病机确立清热活血、解毒化瘀为治疗溃疡性结肠炎基本大法。清热活血方以白术健脾益气、燥湿利水为君药，佐以炙甘草增强其健脾益气之功效；马齿苋具有泻火解毒、清热利湿、行气止痛、凉血止血之功；白芍配炙甘草具有缓急止痛、调和肝脾之效；土鳖虫破瘀消肿、荡涤积滞；三七化瘀止血、通络止痛、行守兼备、去腐生新；诸药合用共奏清热解毒化湿、活血定痛止血之功[7]。本研究发现光镜下可见模型组小鼠结肠黏膜上皮脱落，大量炎性细胞浸润及溃疡形成；而各给药组小鼠结肠黏膜轻度充血肿胀，成纤维母细胞增加，黏膜固有层可见少许炎性细胞浸润，未见明显溃疡。这说明清热活血方具有明确缓解溃疡性结肠炎的效用。

图10　清热活血方高剂量组小鼠结肠黏膜中β-catenin蛋白

图11　正常组小鼠结肠黏膜中Cdx1蛋白表达情况(×10)

图12　模型组小鼠结肠黏膜中Cdx1蛋白表达情况(×10)

图13　清热活血方低剂量组小鼠结肠黏膜中Cdx1蛋白

图14　清热活血方中剂量组小鼠结肠黏膜中Cdx1蛋白

图15　清热活血方高剂量组小鼠结肠黏膜中Cdx1蛋白

图16　正常组小鼠结肠黏膜中Cdx2蛋白表达情况(×10)

图17　模型组小鼠结肠黏膜中Cdx2蛋白表达情况(×10)

图18　清热活血方低剂量组小鼠结肠黏膜中Cdx2蛋白

图19　清热活血方中剂量组小鼠结肠黏膜中Cdx2蛋白

图20　清热活血方高剂量组小鼠结肠黏膜中Cdx2蛋白

β-catenin是Wnt/Wingless信号途径的关键信号分子，Wnt配体通过与frizzled受体以及低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LRP5和LRP6) 结合,引起disheveled蛋白(DVL)的磷酸化而启动该信号通路；继而磷酸化的DVL与Axin 和肿瘤抑制基因APC(adenomatous polyposis coli) 共同阻止糖原合酶激酶(GSK-3β) 对β-catenin的磷酸化[8-9]。没有磷酸化的β-catenin则不被降解系统所识别,最终进入细胞核,并与转录因子TCF4 结合,从而激活下游靶基因Cdx转录[10]。

表1　各组小鼠结肠黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2蛋白阳性表达情况 μm2)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

表2　各组小鼠结肠黏膜中β-catenin 、Cdx1、Cdx2 mRNA表达情况 μm2)

注：①与正常组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05。

图21　正常组小鼠结肠黏膜中β-catenin核内转位情况

图22　模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin核内转位情况

图23　清热活血方低剂量组小鼠结肠黏膜中β-catenin核内转位情况

图24　清热活血方中剂量组小鼠结肠黏膜中β-catenin

图25　清热活血方高剂量组小鼠结肠黏膜中β-catenin

Cdx基因隶属尾状同源异形框基因家族，包含3个同源基因，即Cdx1、Cdx2和Cdx4，其中Cdxl基因和Cdx2基因在正常生物体发育过程中对于肠上皮细胞的增殖和分化具有重要作用[11]。Wnt途径调节Cdx1和Cdx2的表达，Cdx1被证明是Wnt途径的靶基因；Cdx2基因的表达被Wnt途径的靶基因SOX9所阻断[12]。本研究发现，模型组小鼠结肠黏膜中β-catenin存在膜表达缺失、核内异常转位现象，其结肠黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2表达增加；各给药组小鼠结肠黏膜中β-catenin表达以细胞膜为主，核内表达减少，部分可见核内异常转位，并见结肠黏膜中β-catenin、Cdx1、Cdx2表达减少。

综上所述，笔者推测清热活血方可能通过促进β-cate-nin降解，下调Cdx1、Cdx2表达，调控肠上皮细胞增殖，修复肠黏膜屏障而发挥缓解溃疡性结肠炎的效用。

[参考文献]

[1]Dagenais M,Dupaul-Chicoine J,Champagne C,et al. A critical role for cellular inhibitor of protein 2 (cIAP2) in colitis-associated colorectal cancer and intestinal homeostasis mediated by the inflammasome and survival pathways[J]. Mucosal Immunol，2015，9(1):146-158

[2]洪流东，黄会云，陈玉，等. 健脾清热活血类方药对溃疡性结肠炎肠黏膜功能障碍及claudin-2、claudin-5的影响[J]. 中国中西医结合消化杂志，2015，23(9)：599-605

[3]张涛，施斌，陈建永,等. 溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜CINC-1及其受体CXCR2的表达及意义[J]. 世界华人消化杂志，2009，17(1)：79-82

[4]张涛，谢建群. 清肠栓对UC模型大鼠结肠黏膜固有层淋巴细胞Fas、FasL蛋白表达的影响[J]. 江苏中医药，2007，39(8):74-77

[5]Albert EJ,Duplisea J,Dawicki W,et al. Tissue eosinophilia in a m-ouse model of colitis is highly dependent on TLR2 and independent of mast cells[J]. Am J Pathol，2011，178(1):150-160

[6]Alex P,Ye M,Zachos NC,et al.Clcn5 knockout mice exhibit novel immunomodulatory effects and are more susceptible to dextran sulfate sodium-induced colitis[J]. J Immunol，2010，184(7):3988-3996

[7]李华燕，张涛，张颖芹. 健脾清热活血方与美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎的对比研究[J]. 中国中西医结合消化杂志，2011，19(4)：227-231

[8]Sipos F1,Muzes G,Valcz G,et al. Regeneration associated growth factor receptor and epithelial marker expression in lymphoid aggregates of ulcerative colitis[J]. Scand J Gastroenterol，2010，45(4):440-448

[9]Coskun M,Olsen AK,Holm TL,et al.TNF-α-induced down-regulation of CDX2 suppresses MEP1A expression in colitis[J]. Biochim Biophys Acta，2012，1822(6):843-851

[10] Coskun M. The role of CDX2 in inflammatory bowel disease[J]. Dan Med J，2014，61(3):B4820

[11] Coskun M,Troelsen JT,Nielsen OH. The role of CDX2 in intestinal homeostasis and inflammation[J]. Biochim Biophys Acta，2011，1812(3):283-289

[12] Flores MV,Hall CJ,Davidson AJ,et al. Intestinal differentiation in zebrafish requires Cdx1b, a functional equivalent of mammalian Cdx2[J]. Gastroenterology，2008，135(5):1665-1675

Study on the effect of Qingre Huoxue decoction on the expression of β-catenin, Cdx1 and Cdx2 in ulcerative colitis rat models

LI Huayan1,LI Bin1,HUANG Jianbin1,CHEN Yu2,ZHANG Tao2

(1.The Second People’s Hospital of Jiangmen,Jiangmen 529050, Guangdong, China;2.Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530011, China)

Abstract:Objective It is to explore observe the effect of Qingre Huoxue decoction on the expression of β-catenin,Cdx2 and Cdx1 in the treatment of ulcerative colitis rat models, thus to explore the possible mechanism and effect target point of this treatment. Methods 100 Balb/c rats were randomly divided into normal group, blank group, low , middle and high dosage groups of Qingre Huoxue decoction. All the rats in every group except normal group were used to establish ulcerative colitis models by drinking 3% DSS for 2 weeks. Since the 3th week, the normal group and blank group was given the same dose of normal saline by intragastric administration, and every treatment group was treated with different dosage of Qingre Huoxue decoction (3.3 g/kg, 6.6 g/kg, 13.2 g/kg respectively) for one week. All rats were killed at the end of the last administration. The pathological changes of colonic mucosa were detected by HE staining. The expression of Cdx1,β-catenin and Cdx2 were detected by immunohistochemical staining and PCR. The changes of β-catenin in the nucleus were detected by immunofluorescence staining. Results In the blank group, there was a large number of inflammatory cell infiltration and ulcers under the light microscope. While in the treatment group, there was a little inflammatory cell infiltration with no ulcer in it. In the blank group, the β-catenin expression on cell membrane of colon mucosa was absent with abnormal nuclear translocation. And the expression of β-catenin, Cdx2 and Cdx1 increased in the colon mucosa. In treatment group, the expression of β-catenin was mainly in the cell membrane, and the expression of β-catenin, Cdx2 and Cdx1 in the colon mucosa was decreased. The differences were statistically significant(P<0.05). Conclusion Qingre Huoxue decoction may regulate the expression of Cdx1 and Cdx2 by the degradation of β-catenin in order to promote the proliferation of intestinal epithelial cells, with repairing the intestinal mucosal barrier and relieving the symptoms of ulcerative colitis.

Key words:β-catenin signaling way; ulcerative colitis; Qingre Huoxue decoction; Cdx1; Cdx2

[收稿日期]2015-11-25

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)11-1141-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.001

[基金项目]广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFAA011916)；江门市科技局资助项目(12A078)

[作者简介]李华燕，女，副主任医师，主要从事消化系疾病中西医结合研究。[通信作者]张涛，E-mail:327664246@qq.com