CHB患者Th17-Treg失衡中IL-21的作用及机制

耿建　刘瑞霞　高西阳　李彦　潘修成　傅涓涓　李丽

221002　徐州医学院附属医院感染病科



·论著·

CHB患者Th17-Treg失衡中IL-21的作用及机制

耿建刘瑞霞高西阳李彦潘修成傅涓涓李丽

221002徐州医学院附属医院感染病科

【摘要】目的研究慢性乙型肝炎(CHB)患者外周Th17/调节性T细胞(Treg)失衡中IL-21的作用及其初步机制。方法流式细胞仪分别检测59例CHB患者和20例健康人外周血细胞中Th17细胞和Treg细胞频数，同时以ELISA法检测血清细胞因子IL-21、IL-17、IL-10、TGF-β水平。体外分别以IL-21、IL-2刺激CHB患者外周血单核细胞(PBMC)，以实时 PCR 检测培养细胞转录因子RORγt mRNA及Foxp3 mRNA表达水平，以ELISA法检测培养上清细胞因子IL-17、IL-10和TGF-β水平。结果与正常人群相比，IL-21、IL-17、TGF-β水平显著升高(P均<0.05)，CHB患者外周Th17/Treg比例显著升高(P<0.05), IL-21水平与Th17/Treg比例呈正相关(P=0.008)。 与IL-2相比，IL-21刺激CHB患者PBMC的RORγt mRNA表达水平明显升高(P=0.016)而Foxp3 mRNA表达水平明显降低(P=0.018),相对应的培养上清中，IL-17水平显著上升(P=0.049)而IL-10、TGF-β水平明显降低(P=0.017， P=0.004)。结论CHB患者中IL-21能通过提高RORγt mRNA表达，同时抑制Foxp3 mRNA表达进而促进Th17/Treg失衡。

【关键词】白介素-21；慢性乙型肝炎；Th17细胞；调节性T细胞

既往认为，Th1/Th2平衡失调对慢性乙型肝炎(CHB)发挥重要作用[1]。Th17在CHB的发病中促进炎性反应，主要分泌IL-17、IL-21、IL-23等细胞因子；而Treg细胞能够抑制免疫反应，阻止肝组织进一步损伤，主要分泌IL-10、TGF-β、IL-35等细胞因子[2,3]。Th17/Treg比例失衡可能是CHB发病机制中另一重要因素[4,5]。IL-21是近年发现的γc家族细胞因子成员之一，主要由Th17及TFH细胞产生[6]。 IL-21可影响Th17及Treg细胞的产生，可通过干扰foxp3表达而抑制Treg细胞产生，同时通过自分泌途径诱导Th17细胞的发育。本研究分析IL-21在Th17/Treg失衡中的作用。

资料和方法

一、研究对象

徐州医学院附属医院感染性疾病科2012年7月到2012年12月住院及肝炎门诊59例CHB患者，男37例，女22例，年龄(28.5±10.3)岁。ALT为(206±84)U/L，HBsAg为(3.53±0.62) lg IU/mL，HBV DNA为(7.03±0.84) lg IU/mL。诊断标准符合2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》，排除合并其他肝炎病毒感染、自身免疫性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病、肝炎肝硬化等疾病。25名健康对照者来自徐州医学院附属医院健康体检中心，男17名，女8名，年龄(27.0±8.7)岁。

二、流式细胞仪检测外周血中Th17、Treg细胞

取上述研究对象外周新鲜无菌肝素抗凝血和RPMI 1640培养液各100 μL混匀，分别加入5 μL 佛波醇酯(2 μg/mL)、5 μL离子霉素 (50 μg/mL)和4 μL布雷菲德菌素(0.5 mg/mL)。 在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中刺激培养5 h, 取出细胞。流式试管中分别加入PerCP-Cy5.5 抗-人 CD3单抗和FITC 抗-人 CD8单抗各5 μL，再加入100 μL经刺激培养的全血细胞，混匀后室温避光孵育20 min，加入固定剂100 μL，室温避光反应10 min，PBS洗涤细胞1次，离心5 min，弃上清液。再加入破膜剂100 μL ，同时加入 PE 抗-人 IL-17A 单抗或者同型对照抗体5 μL，混匀后室温避光孵育15 min，PBS洗涤，离心后，弃上清。 加入200 μL PBS，上机检测，分析CD3+CD8-IL-17A+细胞即为Th17细胞频数。为检测Treg细胞，另取100 μL肝素化外周新鲜全血加入流式试管中，后加入FITC 抗-人 CD4、PE 抗-人 CD25、AF647 抗-人 CD127各5 μL，充分混匀后，室温避光孵育30 min。加入2 mL红细胞裂解液，室温暗处孵育10 min。室温1200 r/min，离心5 min，并弃去上清。加入3 mL PBS洗涤液，混匀，1200 r/min，离心5 min，并弃去上清。加入300 μL PBS洗涤液重悬细胞后流式细胞仪检测。以上流式抗体均为美国eBioscience公司产品。

三、外周淋巴细胞分离和细胞培养

取CHB患者外周抗凝静脉血5 mL，取等体积的淋巴分离液加入无菌离心管中，将血液沿管壁加入淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min；取中间白膜层，加入适量PBS液洗涤1～2次。用含10%胎牛血清RBMl 1640培养液重悬细胞。将重悬细胞分成3组，IL-2组、IL-21组及PBS对照组，培养48 h后,分别收集培养上清及细胞备检测。

四、细胞因子检测

收集研究对象外周血清和上述细胞培养上清，采用ELISA法测定IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β水平。IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β ELISA检测试剂盒均购自美国R&D公司。

五、RORγt和Foxp3 mRNA表达水平测定

用Trizol法抽提收集培养细胞总RNA，加入适量的无核酶水将RNA稀释为1 μg/μL。根据GenBank中人RORγt及Foxp3基因序列，利用Primer 5.0软件设计出引物：RORγt正向引物5′- AGATACC-CTCACCTACACCTTG -3′，反向引物5′-CCGCTC-AGGGCTGTATTCAA-3′；Foxp3正向引物5′- TGACCAAGGCTTCATCTGTG -3′，反向引物5′- GAACTCTGGGAATGTGCTGTT -3′；GAPDH作为内参对照，正向引物5′- GGGAAACTGTGGCGT-GAT - 3′，反向引物5′- GAGTGGGTGTCGCTGTT-GA -3′。反转录条件按照试剂盒说明书进行，取2 μL得到的cDNA模板进行检测，操作方法参考实时PCR试剂盒说明书，反应条件：95 ℃ 3 min预变性，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40个循环。熔解曲线设定95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后确认实时PCR扩增曲线和熔解曲线以及分析扩增基因表达情况。RORγt及Foxp3 mRNA相对表达量用2-ΔΔCt表示。

六、统计学方法

结果

一、CHB患者外周血Th17、Treg细胞频数及Th17/Treg的比值

采用流式细胞仪测定外周血中Th17、Treg细胞频数，结果如图1所示，与健康对照(1.62±0.71)%相比，CHB患者外周血中Th17频数(2.69±1.44)%显著升高，而Treg频数无显著差异；CHB患者中Th17/Treg比值显著高于健康对照。

二、CHB患者外周血清IL-21水平与Th17/Treg相关关系

相关关系分析表明，CHB患者外周血清IL-21浓度分别与外周血Th17/Treg细胞呈正相关(r=0.380，P=0.008)，见图2，而IL-10、IL-17、TGF-β水平与Th17/Treg比例无明显相关性。

注：1A.Th17细胞流式图；1B.Treg细胞流式图

图2　CHB患者外周血中Th17/Treg与IL-21水平关系

三、CHB患者外周血清IL-21、IL-17、IL-10及TGF-β水平

CHB组血清IL-21为(42.34±34.78) pg/mL、IL-17为(26.60±37.97) pg/mL、TGF-β为(24 726±11 235.81) pg/mL，均明显高于健康对照组的(17.1±11.09)、(7.71±7.62) pg/mL(P=0.002)和(18 249.03±7 603.58) pg/mL(P=0.030)。CHB组血

清IL-10(34.12±33.32) pg/mL高于健康对照组的(25.94±27.01) pg/mL，但差异无统计学意义(P>0.05)。

四、CHB患者的IL-21对PBMC 中RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表达的影响

与IL-2和PBS相比，CHB患者的IL-21使RORγt mRNA表达水平显著升高，而Foxp3 mRNA表达水平显著降低。见图3。

五、CHB患者的IL-21对PBMC 生成细胞因子IL-17、TGF-β及IL-10的影响

各试验组PBMC培养上清中IL-17水平，与IL-2组(16.60±6.00) pg/mL和PBS组(10.61±6.09) pg/mL相比，IL-21组IL-17(41.24±20.36) pg/mL水平显著升高(P=0.049，P=0.018)；与IL-2组IL-10 (161.97±65.16) pg/mL或TGF-β(8 979.20±1 580.19) pg/mL相比，IL-21组IL-10(58.75±45.62) pg/mL或TGF-β(6 763.40±921.57)水平显著下降(P=0.017，P=0.040)。见图4。

图3　CHB患者的IL-21对PBMC中RORγmRNA和FOXp3mRNA表达的影响

图4　CHB患者的IL-21对PBMC产生IL-10、IL-17及TGF-β水平的影响

讨论

介导免疫耐受的Treg细胞和介导炎性反应的Th17细胞之间功能和分化过程相互对抗，正常状态下两者保持平衡，如果Th17/Treg失衡，将引起全身或局部免疫应答异常。与已报道的研究结果一致[4,5,7]，本研究结果显示，CHB患者Th17/Treg比例显著高于正常人群水平，出现失衡状态。提示与Treg相比，CHB患者处于一种Th17细胞增多并趋于优势地位的炎性状态，这可能是导致肝脏炎性反应的重要因素。

细胞因子在CD4+T淋巴细胞向Treg、Th17细胞分化过程中发挥关键作用，TGF-β能促进Treg细胞分化，分泌IL-10、TGF-β及FoxP3表达，而在TGF-β、IL-6及IL-21作用下则促进Th17细胞分化、生成，进而分泌IL-17、IL-23及IL-21等细胞因子[8]。

IL-21是初始CD4+T淋巴细胞向Th17细胞分化和发育过程中必要的细胞因子，同时还可以通过自分泌促进Th17的发育[9]。研究表明，CHB状态下IL-21对HBV感染发挥免疫控制的作用，IL-21可以通过维持HBV特异性CTL细胞功能及促进HBV特异性体液免疫功能控制HBV感染[10-11]。同时，外周血IL-21水平与CHB疾病进展特别是重症肝炎病情严重程度密切相关[12-14]。本研究结果显示CHB患者外周血IL-21、IL-17、TGF-β水平明显高于正常人群，并且IL-21与Th17/Treg显著正相关，提示IL-21不仅是重要的炎性因子，还可能是TH17/Treg比例失调的重要原因。

鉴于IL-21对Th17及Treg的分化及发育过程均有影响，为进一步研究IL-21在CHB患者中Th17/Treg失衡中的作用，以IL-21体外刺激CHB患者PBMCs,并对Th17、Treg各自特异性转录因子RORγt和Foxp3的mRNA水平进行定量检测，结果显示IL-21能显著促进RORγt mRNA表达而降低Foxp3 mRNA表达水平，相对应培养上清中细胞因子的检测中发现，与IL-2相比，IL-21能促进IL-17表达而降低IL-10及TGF-β水平；提示Il-21能通过促进RORγt mRNA表达及抑制Foxp3 mRNA表达调控Th17/Treg，从而导致Th17与Treg细胞比例失衡。

综上分析，本研究在发现CHB患者存在Th17/Treg失衡的基础上，通过体外试验证实了IL-21能促进CHB患者外周血Th17细胞的转录因子RORγt的表达，提高了Th17细胞的活性，同时抑制了Treg细胞的分化，在CHB发病机制中发挥重要作用，这为今后通过调控Th17/Treg失衡进而延缓CHB病情进展的治疗提供了理论和实验依据。

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(本文编辑：钱燕)

The role of interleukin-21 in Th17/Treg imbalance in patients with chronic hepatitis B

GENGJian,LIURui-xia,GAOXi-yang,LIYan,PANXiu-cheng,FUJuan-juan,LILi.DepartmentofInfectiousDisease,AffiliatedHospitalofXuzhouMedicalColleague，Jiangsu221002，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of interleukin-21 in T helper cell 17 (Th17)/regulatory T cells (Treg) imbalance in chronic hepatitis B (CHB) patients, and its mechanism. MethodsFrequencies of Th17 cells and Treg in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of 76 CHB patients and 20 health controls were detected by flow cytometry, and serum levels of interleukin (IL)-21, IL-17, transforming growth factor (TGF)-β and IL-10 were measured by enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). Under stimulation of IL-21 or IL-2 in vitro, levels of RORγt and Foxp3 mRNA in PBMCs were detected by real time reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), and levels of IL-17, IL-10, TGF-β in supernatants were determined by ELISA assay, respectively. ResultsThe level of IL-21 was positively associated with the ratio of Th17 to Treg, which was significantly enhanced in CHB patients when compared with that in health controls (P<0.05). In IL-21 stimulated PBMCs of CHB patients, the expression of RORγt mRNA was significantly increased (P=0.016), while the expression of Foxp3 mRNA was obviously decreased (P=0.018), comparing with those in IL-2 stimulation group. Additionally, level of IL-17 in the corresponding supernatants was notably enhanced (P=0.049), while levels of IL-10 and TGF-β were decreased significantly (P=0.017, P=0.004), respectively. Conclusion IL-21 could enhance the ratio of Th17 to Treg through increasing the expression of RORγt mRNA and decreasing the expression of Foxp3 mRNA in patients with CHB.

【Key words】Interleukin-21; Chronic hepatitis B; Th17 cell; Regulatory T cell

(收稿日期：2015-11-04)

Corresponding author:PAN Xiu-cheng, Email: xzpxc68@126.com

通信作者：潘修成，Email：xzpxc68@126.com

基金项目：江苏省临床医学科技专项 (BL2012043)