中脑导水管周围灰质D-丝氨酸促进大鼠电针耐受

孙梦婕，李尤艳，2，肖智

( 1.遵义医学院研究生学院; 2.遵义市第一人民医院眼科; 3.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义　563000)



中脑导水管周围灰质D-丝氨酸促进大鼠电针耐受

孙梦婕1，李尤艳1，2，肖智3

( 1.遵义医学院研究生学院; 2.遵义市第一人民医院眼科; 3.遵义医学院医学与生物学研究中心，贵州遵义563000)

【摘要】目的:观察大鼠中脑导水管周围灰质( PAG)中D-丝氨酸( D-ser)在大鼠电针耐受形成和维持中的作用并探讨其初步的中枢神经机制。方法: SD大鼠给予多次电针刺激后建立大鼠电针耐受模型;观察电针耐受大鼠机械痛阈( MWT)变化百分数的改变; ELISA法检测大鼠在电针耐受前后PAG中D-ser水平变化;电针耐受大鼠PAG微量注射星形胶质细胞抑制剂－氟代柠檬酸( Fc)后给予电针刺激观察大鼠MWT变化百分数改变。结果:大鼠经多次电针刺激后，其MWT变化百分数逐渐降低伴PAG中D-ser水平逐渐升高;电针耐受大鼠给予Fc后再电针刺激，PAG中D-ser水平下降，大鼠MWT变化百分数升高。结论:多次外周穴位电针刺激导致大鼠电针耐受形成，其机制与PAG中星形胶质细胞活化引起D-ser释放增加有关。

【关键词】电针;耐受; D－丝氨酸;中脑导水管周围灰质

网络出版时间: 2016-3-4 10∶16网络出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20160304.1016.018.html

临床上对多种疼痛采用外周穴位针刺方法进行镇痛治疗，取得很好的镇痛效果。电针( electroacupuncture，EA)是对传统手针进行改进后的一种针刺方法，它通过在外周穴位给予电刺激进而产生镇痛作用。临床已将电针用于手术后疼痛、头痛、痛经、肌筋膜痛、腰背疼痛等多种疾病的镇痛治疗，但长时间或反复多次给予人或动物电针刺激，电针的镇痛效应会逐渐减低以致消失，表现为电针耐受( electroacupuncture tolerance)。由于电针耐受的出现极大的限制了电针在临床镇痛治疗中的运用，因此，对电针耐受形成和维持机制的研究非常重要。

多年研究结果证实，机体存在一个内源性的疼痛调节系统，包括:下行性疼痛抑制系统和下行性疼痛易化系统。中脑导水管周围灰质( periaqueductal gray，PAG)是位于中脑顶盖和被盖之间，围绕中脑导水管的环形区域。PAG是机体内源性镇痛系统的关键部位，在疼痛调制和吗啡耐受的形成、维持机制中均有重要作用［1］。

既往认为细菌和无脊椎动物体内存在D型氨基酸而哺乳动物体内仅存在L型氨基酸，随着研究方法和仪器的进步发现在哺乳动物大脑中也存在D型氨基酸，例如: D-天冬氨酸，D-丝氨酸( D-serine，DSer)等［2］。D-Ser由丝氨酸消旋酶( serine racemase，SR)将L-serine转化而来;同时大量研究提示，DSer可以作为神经递质或胶质递质由神经元和胶质细胞所分泌。N-甲基-D-天门冬氨酸( N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体NR1亚基存在“甘氨酸位点”，该位点被甘氨酸结合后，NMDA受体才能被激活。D-Ser可以与该“甘氨酸位点”结合且结合效能远大于甘氨酸;同时，D-Ser不能被甘氨酸转运体所转运，因而不受重吸收机制的调节。由于NMDA受体参与机体多种生理、病理机制的调节过程，因此，D-Ser可以通过调节NMDA受体的功能介入多种生理、病理过程的调节机制。

对吗啡耐受机制的研究中发现，慢性吗啡治疗可引起NMDA受体活化，细胞内Ca2 +水平增加，激活胞内PKC信号途径，最后引起μ阿片受体磷酸化，吗啡耐受形成。由于吗啡耐受和电针耐受存在交叉耐受，因此，D-Ser可能也通过调节NMDA受体功能参与电针耐受的形成和维持机制。明确PAG 中D-Ser是否介入大鼠电针耐受的机制是本研究的主要目的。

本研究将通过建立电针耐受大鼠模型，观察电针耐受大鼠中脑PAG中D-Ser水平变化;此外在电针耐受大鼠PAG中给予星形胶质细胞活化抑制剂氟代柠檬酸( fluorocitrate，Fc)后观察Fc对大鼠电针耐受的影响。通过本研究可以加深对电针耐受机制的认识，为开发“只镇痛少耐受”的新型镇痛药物提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物及分组

清洁级成年雄性Sprague-Dawley( SD)大鼠共84只购于重庆第三军医大学，体重210～220 g，实验期间分笼饲养，3～4只大鼠1笼;大鼠置于安静，温度( 24±1)℃，湿度( 60±5) %，人工光照，明暗各12 h/d( 8AM-8PM)周期的环境中饲养，自由进食及饮水。本实验严格按照国际疼痛研究协会( International Association for the Study of Pain，IASP)关于应用动物进行疼痛研究的伦理纲要进行操作，实验过程中尽量减少动物的不适和动物的使用量。

按照随机数字表法将84只大鼠随机分为7组( n =12) :正常组( normal)、假电针组( sham-EA)、电针组( EA)、电针+人工脑脊液组( artificial cerebrospinal fluid，aCSF) ( EA + aCSF)和电针+ Fc组( EA + Fc) ; EA + Fc组按照Fc剂量再分为EA +0. 3 μg Fc、EA +0. 6 μg Fc和EA + 1. 2 μg Fc低、中、高剂量3个亚组;正常组不作任何处理，单纯饲养; EA组、EA + aCSF组、EA + Fc组大鼠给予外周穴位电针刺激，1次/d，共6次; EA + aCSF组和EA + Fc组大鼠给予PAG外侧区( lateral subregion of the PAG，lPAG)植管并通过植管微量注射aCSF或不同剂量Fc。假电针组大鼠仅在外周穴位给予针刺，不通电流。

1.2主要实验仪器及试剂

电子Von Frey测痛仪( IITC Life science公司，2390系列，美国)、冰冻切片机( Leica CM1950，德国)、脑立体定位仪( Narishige公司，SR-6R，日本)、全波长酶标仪( Multiskan，美国)。氟代柠檬酸( Sigma Aldrich公司，美国)，溶于无菌生理盐水中，浓度为10 μg /μL，微量注射时按需要稀释成适合的终浓度。lPAG中微量注射量为( 0. 3 μg /0. 3 μL、0. 6 μg/0. 3 μL或1. 2 μg /0. 3 μL)。D-serine酶联免疫分析试剂盒购于上海酶研生物科技有限公司。人工脑脊液中各种离子成份及其浓度( mmol/L) 为: NaCl 126，KCl 5，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41. 25，NaHCO326，葡萄糖10。

1.3动物模型建立

将大鼠置于固定笼内，双后肢及尾暴露于固定笼外，采用经穴电针治疗仪(华信经穴电针治疗仪HXZ-I-6型，成都)给予大鼠双后肢“足三里”和“三阴交”穴位进针，足三里:大鼠后膝关节下方，腓骨小头下约5 mm;三阴交:在小腿内侧，内踝尖上3 mm，胫骨内侧缘后方;进针部位和针用75%酒精消毒。参照Huang的方法［3］建立大鼠电针耐受模型:大鼠在清醒状态下给予方波刺激，波宽0. 2 ms，频率100 Hz，按照1-2-3 mA强度递增，每个强度维持10 min;每次电针30 min后检测机械痛阈值( mechanical withdrawal threshold，MWT)，共电针6 d( 1 次/d)，随刺激时间延长，电针的镇痛效果逐渐降低导致电针耐受形成［4］。

1.4机械痛阈值的检测

测定机械痛阈值( mechanical withdrawal threshold，MWT)时，室温维持在20～24℃，保持周围环境安静。先将大鼠置于底带孔的透明有机玻璃笼中30 min以上，使大鼠适应环境，待大鼠停止行走、抓挠、直立、排便等活动处于安静状态后开始检测。通过网孔用电子von Frey纤维刺激大鼠后肢足底中部2 s，出现缩足反应时读数为MWT。建模前( 0 d)和建模后每天检测大鼠MWT变化百分数直到电针后6 d。检测时间点为电针前( 0 d，此时为大鼠基础痛阈)以及电针后每天的MWT并与基础痛阈相比求得机械痛阈变化百分数( %) = (电针后MWT值－基础MWT值) /基础MWT值×100%。MWT检测在每次电针刺激后4 h进行。

1.5中脑导水管周围灰质植管及微量注射

EA + aCSF组和EA + Fc组大鼠在建模前5 d给予4%水合氯醛麻醉( 10 mL/kg)，麻醉成功后，大鼠俯卧位置于脑立体定位仪上，切开头皮，暴露颅骨，钻孔，在PAG外侧区( lateral PAG，lPAG)植管。lPAG的坐标为:前囟后7. 80 mm，中线旁开0. 60 mm，颅骨表面下4. 5 mm。插入外直径0. 8 mm的不锈钢插管，用牙科磷酸锌水门钉固定，单侧插管，在插管内放入一内芯，防止插管堵塞。植管后给予青霉素钠盐(溶于2 mL无菌盐水)腹腔注射预防感染和脱水。手术结束后放入笼中，保温直到麻醉苏醒。插管完成后，每日观察大鼠的一般情况，生命体征以及运动功能变化，如果出现神经系统功能障碍(瘫痪、呼吸异常、插管脑脊液漏)等，排除在实验组外。大鼠电针刺激后6 d给予lPAG微量注射aCSF或不同剂量Fc，1次/d，连续3 d。注射药物前轻度固定大鼠，用微量进样器连接注射针头后给予注射，注射针头长于导管1 mm。每次注射0.3 μL，3 min内注射完毕，留针2 min，确保药物的完全扩散。整个实验结束时，通过微量进样器注入2%伊文思蓝0.1 μL，确定注射部位并与大鼠脑图谱［5］比对，只有注射部位位于lPAG的大鼠数据才纳入统计处理。

1.6 ELISA

大鼠麻醉后断头取脑，在冰盘上迅速摘取中脑，取PAG组织约100 mg，按照100 mg/mL加入PBS，pH7. 4，用液氮迅速冷冻保存备用。标本解冻后保持在2～8℃。匀浆后4℃3 000 r/min离心20 min，收集上清液约500 μL。BCA试剂盒(碧云天)进行总蛋白定量后，严格按照酶联免疫分析试剂盒使用说明书操作检测PAG中D-Ser的含量(设置空白孔、标准品孔、待测样品孔，分别进行加样。37℃温育30 min后弃去液体，洗板30 s×5次。加入酶标试剂50 μL，温育30 min后弃去液体，洗板30 s× 5次。加入显色剂A和B各50 μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10 min，加入终止液50 μL终止反应)。反应终产物在酶标仪以450 nm波长下测量各孔的吸光度( OD值)，应用计算机软件根据标准曲线的直线回归方程计算对应的样品D-ser蛋白浓度。

1.7统计学分析

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，不同时间点组内比较采用重复测量方差分析;多组间数据比较采用两因素方差( Two-Way ANOVA)和Post hoc Turky分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠持续电针刺激后耐受形成

EA组大鼠EA刺激1 d后，MWT变化百分数为( 86. 7±12. 7) %，与正常组MWT变化百分数比较，差异有统计学意义( P＜0.001) ;连续6 d给予电针刺激，MWT变化百分数逐渐变小，第6次电针刺激后MWT值变化百分数为( 3. 5±2. 4) %，与正常组大鼠MWT变化百分数比较，差异无统计学意义，说明随着电针刺激次数的增多，电针的镇痛效应逐渐降低，电针耐受形成。假电针组大鼠在各观察时间点与正常组大鼠MWT变化百分数比较，差异无统计学意义(图1)。

2.2电针耐受大鼠PAG中D-serine水平变化

取电针6次后时间点的正常组、假电针组和电针组大鼠，ELISA法检测PAG中D-ser水平情况。结果提示:电针组大鼠PAG中D-ser水平增加，与正常组比较，差异有统计学意义( P＜0. 001) ;假电针组大鼠PAG中D-ser水平与正常组大鼠比较，差异无统计学意义(图2)。

2.3 lPAG中微量注射氟代柠檬酸对电针耐受大鼠机械痛阈变化百分数的影响

取电针耐受大鼠，给予lPAG中微量注射人工脑脊液或不同剂量Fc ( 0.3 μg、0.6 μg或1.2 μg)，1次/d，连续给予3 d，同时给予外周穴位电针刺激1次/d，共3次。观察注射人工脑脊液或Fc后大鼠MWT变化百分数。EA +0.3 μg Fc组与EA + aCSF组大鼠比较，MWT变化百分数差异无统计学意义。EA + 0.6 μg Fc组和EA + 1.2 μg Fc组与EA + aCSF组比较，差异有统计学意义( P＜0. 001) ; EA + 0.6 μg Fc组与EA +1.2 μg Fc组比较，差异有统计学意义( P＜0. 001) (图3)。

图1　多次电针刺激对大鼠MWT变化百分数的影响*P<0.001,#P<0.01，与同时间点正常组大鼠比较。

图2　大鼠PAG中D－ser水平*P<0.001,与正常组大鼠比较。

图3　lPAG微量注射Fc对电针耐受大鼠机械痛阈变化百分数的影响*P<0001,与EA+aCSF组大鼠比较；#P<0001,与EA+0.6 μg Fc组大鼠比较。

2.4 lPAG中微量注射氟代柠檬酸对PAG中D-ser水平的影响

取电针耐受大鼠，给予lPAG中微量注射人工脑脊液或不同剂量Fc ( 0.3 μg、0.6 μg或1.2 μg)，1次/d，连续给予3 d，同时给予外周穴位电针刺激1 次/d，共3次。观察注射人工脑脊液或Fc对大鼠PAG中D-ser水平的影响。EA +0.3 μg Fc组与EA + aCSF组大鼠比较，PAG中D-ser水平差异无统计学意义。EA +0.6 μg Fc组和EA +1.2 μg Fc组与EA + aCSF组比较，PAG中D-ser水平差异有统计学意义( P＜0. 001) ; EA + 0.6 μg Fc组与EA + 1. 2 μg Fc组比较，PAG中D-ser水平差异有统计学意义( P＜0. 001) (图4)。

图4　lPAG微量注射Fc对电针耐受大鼠PAG中D－ser水平的影响*P<0.001,与EA+aCSF组大鼠比较；#P<0001,与EA+0.6 μg Fc组大鼠比较。

3　讨论

本研究通过对大鼠进行多次外周穴位电针，观察在电针耐受的形成和维持中，大鼠PAG中D-ser水平的变化。主要研究结果包括以下几个方面:( 1)多次电针刺激引起大鼠机械痛阈变化百分数逐渐减小，电针耐受形成; ( 2)电针耐受大鼠与正常大鼠比较，PAG中D-ser水平升高; ( 3)电针耐受大鼠PAG中微量注射Fc后，大鼠机械痛阈变化百分数增加，电针耐受症状缓解。

普遍认为，电针耐受和吗啡耐受的机制有许多共同点，且存在交叉耐受［6］，导致吗啡耐受的机制同样可能引起电针耐受。当前研究已经明确的引起吗啡耐受的主要机制包括: ( 1)阿片受体改变，表现为受体表达量变化或受体内化、G蛋白信号通路脱偶联以及阿片受体的各受体亚型之间的相互作用等; ( 2)内源性阿片拮抗系统的活化，包括:孤啡肽及其受体、去甲肾上腺素、八肽胆囊收缩素( CCK-8)和神经肽FF等; ( 3) NMDA受体活化，一氧化氮( NO)生成增多等促进吗啡耐受形成。此外，近年发现，中枢神经系统胶质细胞活化也与吗啡耐受的形成和维持有关［7－8］。

PAG是阿片镇痛和阿片耐受的关键部位，特别是其腹外侧区［9－10］。近年研究提示PAG中小胶质细胞活化后脑源性神经营养因子( BDNF)释放增多和NMDA受体表达上调促进吗啡耐受形成［11］。本研究中发现，随着电针次数的增多，大鼠机械痛阈变化百分数逐渐减少，提示大鼠电针耐受的出现;同时也观察到，伴随电针耐受的出现，大鼠PAG中D-ser水平的增高。说明PAG中D-ser水平的改变介入了大鼠电针耐受机制。

给予外源性甘氨酸可以增强NMDA受体对NMDA的反应，进一步研究发现，甘氨酸结合于NMDA受体的甘氨酸位点是谷氨酸激活NMDA受体的基础［12］。然而，通过近年来的研究发现，在多个脑区，D-ser才是NMDA受体甘氨酸结合位点的内源性配体［13－14］。D-ser的分布与NMDA受体表达分布平行。D-ser通过可以调节NMDA受体功能，参与对突触可塑性、感觉信息传递、神经发育、神经毒理以及神经系统疾病(帕金森病、阿尔兹海默病、精神分裂症等)机制的调节过程，同样D-ser也可以通过调节NMDA受体的功能参与电针耐受的形成。

Chen等［15］发现:慢性吗啡治疗引起脊髓背角星形胶质细胞活化和D-ser释放增多，大鼠出现吗啡耐受表现;鞘内给予D-氨基酸氧化酶( D-amino acid oxidase，DAAO)降低D-ser水平后可缓解大鼠吗啡耐受表现，说明星形胶质细胞活化和D-ser介入吗啡耐受的脊髓机制。在中枢神经系统，星形胶质细胞通过囊泡释放或出胞作用释放D-ser，值得一提的是近期研究发现，神经元也能释放D-ser和甘氨酸［16］。那么本研究中发现电针耐受大鼠PAG中D-ser水平增高，D-ser来源于何种细胞，我们采用星形胶质细胞活化抑制剂Fc进行验证。Fc通过抑制顺乌头酸酶，干扰细胞内三羧酸循环，对星形胶质细胞活化有特异性的抑制作用。通过给予Fc抑制星形胶质细胞的活化达到镇痛的文献报道较多，但采用Fc观察胶质细胞在吗啡或电针耐受中的作用的研究相对较少。本研究通过在PAG中微量注射Fc抑制星形胶质细胞活化后，PAG中D-ser水平下降并与Fc剂量相关，大鼠电针耐受症状缓解，其机制可能与Fc抑制PAG中星形胶质细胞活化减少D-ser的释放有关。本课题组前期对神经病理性疼痛大鼠的研究中发现，大鼠PAG中D-ser水平的升高，达到( 1 800±327) ng/L，对大鼠的疼痛起缓解作用，其机制可能与PAG中NMDA受体的激活有关［17］。本研究发现，电针耐受大鼠其PAG中D-ser水平进一步增加，达到( 5 200±626) ng/L左右，由于D-ser水平的大幅增加，可能引起NMDA受体的过度激活，最终导致大鼠电针耐受的形成和维持。

以前认为中枢神经系统的胶质细胞仅仅起营养和支持作用，近年研究提示胶质细胞通过释放胶质递质、促炎症细胞因子等广泛参与中枢神经系统功能调节。本研究结果证实PAG中星形胶质细胞活化后通过促进D-ser释放介入电针耐受的形成和维持机制。本研究一方面加深了对电针耐受机制的认识，另一方面为开发“只镇痛少耐受”的新型镇痛药物或镇痛方法提供新的理论依据。

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(学术编辑:张晓东)

论著

Midbrain periaqueductal gray D-serine facilitates electroacupuncture tolerance in rats

SUN Meng-jie1，LI You-yan1，2，XIAO Zhi3
( 1.Graduate School，Zunyi Medical College; 2.Department of Ophthalmology，the First People’s Hospital of Zunyi City; 3.Research Center for Medicine＆Biology，Zunyi Medical College，Zunyi 563000，Guizhou，China)

【Abstract】Objective: To investigate the role of midbrain periaqueductal gray ( PAG) D-serine( D-ser) in the mechanism of the electroacupuncture ( EA) induced tolerance in rats.Methods: Male Sprague-Dawley( SD) rats were randomly divided into 7 groups，namely，normal group，sham-EA group，EA group，EA plus artificial cerebrospinal fluid ( aCSF) group and EA plus Fc group.The EA plus Fc group was divided into low，middle and high Fc subgroups，and had 0. 3μg，0. 6μg and 1. 2μg Fc intra-PAG injection，respectively.The mechanical withdrawal threshold ( MWT) values were detected via an electronic von Frey apparatus.The ELISA technique was used for determination the alterations of D-ser level in the rats PAG on each observation time point.The effects of intra-lateral PAG ( lPAG) injection of Fc，a glial metabolic inhibitor，on MWT values and D-ser concentrations were further studied on EA tolerant rats.Results: In EA tolerant rats，the MWT percentage changes gradually decreased with an increase of D-ser levels in the PAG.The intralPAG injection of Fc increased the MWT percentage changes.Conclusion: Multiple EA treatments can induce tolerance via an astrocyte activation and an increased D-ser release in the PAG on rats.

【Key words】Electroacupuncture; Tolerance; D-serine; Midbrain periaqueductal gray

作者简介:孙梦婕( 1984－)，女，硕士研究生。通讯作者:肖智，E-mail: xiaozhi1971@163.com

基金项目:国家自然科学基金课题( 31160207)

收稿日期:2015－06－14

doi:10. 3969/j. issn. 1005-3697. 2016. 01.09

【文章编号】1005-3697( 2016) 01-0029-06

【中图分类号】R745.42; R245.97

【文献标志码】A