一株红酵母的筛选、鉴定及硝化作用

孙 　 蕾，　李 　 成，　马 树 瑞，　崔 　 静，　牛 庆 昌，　丛 丽 娜

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连　116034 )



一株红酵母的筛选、鉴定及硝化作用

孙 蕾，李 成，马 树 瑞，崔 静，牛 庆 昌，丛 丽 娜

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连116034 )

摘要:从海参肠道中筛选出一株红酵母菌HS-J4，对其进行形态、培养特性分析及26S rDNA序列测定，建立了系统发育树，初步鉴定该菌株为胶红酵母。通过测定红酵母的生长曲线，确定红酵母的最佳发酵时间为24 h，并检测了胶红酵母HS-J4对实验室配制的人工污水及海参养殖污水中亚硝酸盐和氨氮的清除能力。结果表明，HS-J4菌体对人工污水中高浓度的氨氮和亚硝酸盐氮均有良好的去除效果，清除率分别为42.3%和34.8%。应用于海参养殖污水时，HS-J4对水体中亚硝酸盐的去除率达到56.8%。筛选得到的胶红酵母HS-J4具有较高的硝化能力，可为养殖水质改良的实际生产提供有效参考。

关键词:红酵母菌；氨氮；亚硝酸盐氮

0引言

为满足人们对海参产品日益增多的需求，辽东半岛海参养殖业发展迅速，养殖出现集约化，逐渐增加饵料的投入量、药物的使用量等[1]。这使得海参养殖水体中亚硝酸盐含量日益增加，严重影响海参的健康[2]。养殖水体中亚硝酸盐是水产动物致病的重要根源，其浓度过高会引起水体动物中毒死亡。因此，去除海参养殖水体的亚硝酸盐氮是目前领域研究的热点[3]。

目前，通过微生物的反硝化作用可以去除养殖水体中的亚硝酸盐[4]。近些年，利用微生物(真菌、细菌、酵母菌)降解养殖水体中亚硝酸盐的研究及其应用受到人们的高度重视[5-6]。其中，酵母菌属中的红酵母在净化养殖水质方面应用较广。例如，李静等[7-8]为了探索具有食品安全性的亚硝酸盐去除方法，研究了深红酵母降解亚硝酸盐的工艺条件和粘红酵母好氧反硝化的特性；吴伟等[9]对影响假丝酵母降解亚硝酸盐的各种主要因素进行了研究。以上结果表明红酵母菌属对亚硝酸盐具有一定的清除能力。

本实验立足从海参体内筛选出具有硝化能力的红酵母菌，为海参养殖水质净化益生菌的开发提供优良菌株和实验数据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌种

菌种筛选所用样本来自辽宁省大连市长海县参养殖圈内海水及海参肠道。

1.1.2培养基

筛选富集培养基：称取去皮马铃薯200 g，切成小块，1 L水煮沸1 h，过滤添加去离子水至1 L。

YEPD培养基：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，去离子水1 L，自然pH。

发酵培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，硫酸铵15 g，磷酸二氢钾2.5 g，去离子水1 L，pH 6.7

1.2方法

1.2.1红酵母的筛选

富集：取样大连长海县海参，在无菌条件下将海参肠道取出、剪碎，无菌生理盐水冲洗2～3次，将冲洗液及剪碎的海参肠一同放入含有小玻璃珠的富集培养基，30 ℃、160 r/min富集培养48 h。

纯化：将富集培养液以5%的接菌量，接入灭菌后加入100 mg/L青霉素(青霉素药物会杀死细菌和霉菌，为酵母菌提供适宜的生长环境[10-11])的YEPD液体培养基中，30 ℃、160 r/min培养48 h。将菌液进行10-1～10-9的梯度稀释，平板涂布在YEPD固体培养基上，30 ℃培养48 h。挑取颜色大小不同的菌株进行菌落划线分离纯化，直至在显微镜下观察为纯种酵母细胞。根据菌落形态和颜色筛选出一株红酵母，将得到的菌株于YEPD斜面培养基4 ℃保藏。

1.2.2红酵母的鉴定

形态学鉴定:将筛选得到的红酵母菌制片，在显微镜下观察酵母菌的细胞形态。

分子生物学鉴定:由宝生物工程有限公司对菌株进行26S rDNA D1/D2区序列测定。

系统发育树构建:将测序结果提交GenBank，根据同源序列搜索结果，下载相关菌种的26S rDNA 序列[12]。进行序列比对，选取相似性最高的9条序列，使用MEGA 5.0构建系统发育树。

1.2.3红酵母生长曲线的测定

将筛选的红酵母进行活化，4%接种量接种发酵培基，30 ℃、160 r/min培养。采用比浊法进行测定。对细胞密度大的培养液用空白发酵培养基适当稀释后测定，测得的光密度为0.1～0.65。

1.2.4红酵母对氨氮、亚硝酸盐的清除能力

配置人工污水(氨氮1.25 mg/L，亚硝酸盐7 mg/L，pH 7.0)，将红酵母菌株培养液离心(4 000 r/min、15 min)收集湿菌体，按10 g/L 接入，于28 ℃、180 r/min振荡培养5 d。24 h取样1次，分别检测红酵母对人工污水中氨氮和亚硝酸盐的清除能力及水体pH的变化。

1.2.5红酵母对海参养殖污水的净水能力

选取海参育苗池倒池前的养殖污水(鑫玉龙海参养殖公司，起始氨氮0.762 mg/L，亚硝酸盐1.865 mg/L，pH 7.14)进行实验。分别检测HS-J4 对海参养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的清除能力及对水质pH的影响。

1.2.6亚硝酸盐的测定

采用盐酸N-(1-萘)-乙二胺光度法测定上清液的亚硝酸盐[13]。每次取5 mL水样， 12 000 r/min离心20 min，收集上清液，检测海参养殖水体在不同时间的亚硝酸盐含量。

1.2.7氨氮的测定

采用水杨酸-次氯酸盐光度法测定上清液的氨氮含量[14]。每天取5 mL水样于12 000 r/min离心20 min，收取上清液，检测海参养殖水体在不同时间的氨氮含量。

2结果与分析

2.1红酵母菌株的筛选及形态学分析

通过富集、纯化，共筛选出10株酵母菌。根据菌落颜色从中筛选出一株红酵母，命名为HS-J4。在10×40显微镜下，观察菌落形态呈圆形(图1(a))，以出芽的方式进行生殖(无性生殖，图1(b))。

图1　HS-J4菌落形态及光学显微镜下细胞形态

2.2分子生物学鉴定HS-J4菌株的种属

对菌株HS-J4进行26S rDNA分子生物学鉴定，测序长度为526 bp。序列已提交到GenBank，检索号为KF6682430.1。

2.3构建系统发育树

测序得HS-J4菌株的26S rDNA序列，利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/pubmed/)的“Blast”进行比对。经序列比对分析发现，GenBank数据库中与HS-J4序列相近的菌株属于红酵母属(Rhodotorula)。

根据Blast比对结果，选取与HS-J4高度相似性的9条序列，进行系统发育树的构建(图2)。HS-J4菌株位于Rhodotorula独立分支上，与菌株RhodotorulamucilaginosaWT6-5的序列覆盖度为100%，最大序列相似度到达99%。通常认为，同种间菌株的大亚基5′端D1/D2区域的差异不超过1%[15]。由此可以确定HS-J4菌株均属于胶红酵母菌种(Rhodotorulamucilaginosa)。

图2　菌株HS-J4及其相关菌株的26S rDNA基因全序列构建系统发育树

2.4测定HS-J4的生长曲线

测定培养液不同时段的OD600，绘制HS-J4生长曲线(图3)。菌株HS-J4在0～5 h为生长延滞期；从5 h开始进入对数生长期；24 h后，菌体停止分裂，进入平台期。根据HS-J4菌株的生长曲线，确定后续投入养殖水体中的菌体为发酵24 h的HS-J4发酵湿菌体。

图3　HS-J4生长曲线图

2.5HS-J4净水能力的检测结果与分析

2.5.1HS-J4对人工污水和海参养殖污水亚硝酸盐氮的清除作用

将湿菌泥10 g/L接入污水中，检测胶红酵母HS-J4对人工污水和海参养殖污水中亚硝酸盐氮的净化情况(图4)。由图4可知，HS-J4投入人工污水1～2 d亚硝酸盐迅速下降，去除率达34.8%。养殖水体投入湿菌泥后，亚硝酸盐氮去除率快速上升，第3天，HS-J4对水体中亚硝酸盐氮的去除率达56.8%；4 d后，水体内的亚硝酸盐氮质量分数略有升高，处于水体最初的亚酸盐氮质量分数的60%左右。结果表明，HS-J4对高浓度和低浓度亚硝酸盐氮都具有明显的、快速的清除作用。

图4HS-J4菌株对人工和养殖污水中亚硝酸盐的清除率

Fig.4ThescavengingratesofnitritenitrogenintheartificialandaquaculturewastewaterbyHS-J4strain

2.5.2HS-J4对人工污水和海参养殖污水氨氮的清除作用

将湿菌泥10 g/L接入污水中，检测胶红酵母HS-J4对人工污水和海参养殖污水氨氮的清除能力(图5)。由图5可知，HS-J4对人工污水具有明显的去除作用，第2天去除率达到最高42.3%。根据测定，海参养殖污水初始的氨氮含量很低，投入湿菌泥后海参养殖污水的氨氮去除率缓慢升高，第3天HS-J4对水体中氨氮的清除率达8%。4～5 d氨氮含量总体水平保持稳定。实验结果表明HS-J4对高浓度的氨氮具有明显的清除作用，对养殖水体中氨氮具有一定的去除能力。

图5　　　HS-J4菌株对人工和养殖污水中氨氮

Fig.5ThescavengingratesofammonianitrogenintheartificialandaquaculturewastewaterbyHS-J4strain

由图6可知人工污水的pH整个过程有明显的下降。海参养殖污水1～4d水质维持pH7.0左右，在整个过程中水质pH6.8～7.0保持平稳。实验结果表明红酵母在养殖水质恶化状态下可以发挥去除氨氮、亚硝酸盐氮的作用。

图6　　　　HS-J4菌株对人工和养殖污水中水质

3结论

从海参肠道中筛选出了一株红酵母命名为HS-J4，通过形态学及分子生物学鉴定为胶红酵母菌。胶红酵母对人工污水和养殖污水中的亚硝态氮去除率分别达 34.8%和56.8%，对人工污水中高氨氮的除率达42.3%，对于低氨氮的养殖污水去除能力较低。因此，胶红酵母HS-J4具有降解氨氮、亚硝酸盐，改善养殖环境的作用，为开发海参养殖水体水质改良剂提供可选菌株。

参考文献:

[1] 戴德渊,张学文,钟丽红,等.水产养殖的危害源分析[J].饲料研究,2004(9):41-43.

[2] 高明辉,马立保,葛立安,等.亚硝酸盐在水生动物体内的吸收机制及蓄积的影响因素[J].南方水产,2008,4(4):73-79.

[3]XIAS,LIJ,WANGR.Nitrogenremovalperformanceandmicrobialcommunitystructuredynamicsresponsetocarbonnitrogenratioinacompactsuspendedcarrierbiofilmreactor[J].EcologicalEngineering, 2008, 32(3): 256-262.

[4] 孔庆鑫,李君文,王新为,等.一种新的好氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现[J].应用与环境生物学报,2005,11(2):222-225.

[5] 杭小英,施伟达,叶雪平,等.枯草芽孢杆菌制剂对罗氏沼虾养殖池水质的影响[J].浙江海洋学院学报,2008,27(2):197-200.

[6] 李春,韩建春,郑凯.乳酸菌混合生长降解亚硝酸盐能力的研究[J].工业微生物,2008,38(6):23-26.

[7] 李静,邓毛程,廖凡,等.粘红酵母好氧反硝化特性研究[J].广东农技,2012(13):180-182.

[8] 李静,廖帆,余运红,等.深红酵母降解亚硝酸盐的研究[J].广东轻工职业技术学院学报,2011,10(3):28-30.

[9] 吴伟,余晓丽,李咏梅,等.假丝酵母对养殖水体中亚硝酸盐的降解特性[J].中国环境科学,2001,21(1):8-11.

[10] 高鹏,丛丽娜,窦赫喆,等.海参肠道中高产胞外多糖酵母的筛选及发酵条件[J].大连工业大学学报,2014,33(3):157-160.

[11] YANG S P, WU Z H, JIAN J C. Effect of marine red yeastRhodosporidiumpaludigenumon growth and antioxidant competence ofLitopenaeusvannamei[J]. Aquaculture, 2010, 309(40): 62-65.

[12] 唐玲,刘平,黄瑛,等.酵母的分子生物学鉴定[J].生物技术通报,2008(5):84-87.

[13] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].北京:中国环境科学出版社,2002.

[14] 胡小玲,吴鹏.水杨酸-次氯酸盐测定水中氨氮方法的改进[J].干旱环境监测,2005,19(3):184-185.

[15] PETERSON S W, KURTZMAN C P. Ribosomal RNA sequence divergence among sibling species of yeasts[J]. Systematic and Applied Microbiology, 1990, 14(2): 124-129.

Screening, identification and nitrification of a marineRhodotorulastrain

SUNLei,LICheng,MAShurui,CUIJing,NIUQingchang,CONGLina

( School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

Abstract:A marine Rhodotorula strain named HS-J4 was isolated from sea cucumber intestine. It was identified as a Rhodotorula mucilaginosa strain analysed by the characterization of morphology, 26S rDNA and the phylogenic tree. The best fermentation time for cell growth of HS-J4 was 24 h, and the scavenging activities for the nitrite and ammonia nitrogen in artificial wastewater and aquaculture wastewater was determined. The results showed that the removal rates of the ammonia nitrogen and nitrate could reach to 42.3% and 34.8% in the artificial wastewater, while the removal rate of nitrate was 56.8% in aquaculture wastewater for sea cucumber. The results showed that HS-J4 had high capability of removing the nitrite and ammonia nitrogen, which laid a good foundation for the further application in the aquaculture water.

Key words:Rhodotorula; ammonia nitrogen; nitrate nitrogen

中图分类号:TS254.2；S917.1

文献标志码:A

作者简介:孙 蕾(1990-)，女，硕士研究生；通信作者：丛丽娜(1962-)，女，教授，E-mail:congln@dlpu.edu.cn.

基金项目:海洋公益性行业科研专项(201405003-3)；辽宁省高等学校重大科技平台专项(LT2011008).

收稿日期:2015-02-02.

文章编号:1674-1404(2016)02-0088-04