氨氮降解菌株的筛选及降解性能研究

张国伟，靳静晨，李晨晨，高宇轩，高雅娟，张闻天，靳永胜*

1.北京农学院生物与资源环境学院，北京102206；

2.北京环氧环保科技发展有限公司，北京100101

目前，我国氨氮污染排放量已远远超出受纳水体的环境容量，氨氮指标已超过化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）指标成为影响地表水环境质量的首要指标［1］，且大量研究表明，氨氮指标超标会使江河湖泊水体逐渐富营养化［2-5］。为防止水体环境不断恶化，国家对主要污染物，如氮、磷的排放制定了严格的标准，目前生物除氮因具有低耗、高能、可持续性强等特点广泛应用于污水处理厂［6］。

科学家已发现了大量具有氨氮降解能力的菌株，如假单胞菌（Pseudomonassp.）［7-10］、粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）［11］、芽 孢 杆 菌（Bacillussp.）［12］、酵母［13-14］等。目前越来越多的真菌被证实同样具有去氮的能力，如李伟斯［15］从河流底泥中筛选出1株链格孢属（Alternariasp.）真菌，其能够利用多种有机碳源进行生长和反硝化；杨晓华［16］从焦化废水处理单元活性污泥中筛选出1株镰刀菌属（Fusariumspp.）丝状真菌，具有较强的适应能力，初始浓度为450 mg·L-1氨氮的去除率为94.75%。刘志云［17］从鸡粪中筛选出1株拟宛氏青霉菌HL，在初始氨氮浓度为300 mg·L-1时，菌株HL的氨氮降解率为80.53%；戚文静等［18］从活性污泥中筛选出1株Galactomyces属的菌株AD-7，初始氨氮浓度291.16 mg·L-1，接种量2.21%时氨氮降解率预测值为100%，实测值仍可达到99%；曾忠强等［19］将白腐真菌丝状生物膜固定在中空的脉管载体上，构建的新型白腐真菌反应器可以控制气泡和废水流完成18批次（共进行401 d）的垃圾渗滤液连续处理，氨氮含量指标（ammonia nitrogen content index，NH3-N）和COD去除率分别达83%～97%和56%～74%。本研究从垃圾渗滤液中分离筛选出1株具有降解高氨氮能力的真菌，对其进行形态学和分子鉴定，并分析了该菌的氨氮降解特性，旨在为污水中去除氨氮提供安全、有效、经济的功能菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 由北京南宫垃圾堆肥厂的垃圾渗滤液中筛选出1株具有氨氮降解能力的菌株。

1.1.2 培养基配比 富集培养基：葡萄糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO42.0 g·L-1，FeSO·47H2O 0.4 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，MgSO·47H2O 0.5 g·L-1，其余为去离子水，pH为7.2～7.4。

分 离 培 养 基：葡 萄 糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO42.0g·L-1，FeSO·47H2O 0.4 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，MgSO·47H2O 0.5 g·L-1，琼脂20 g·L-1，其余为去离子水。

筛 选 培 养 基：葡 萄 糖5.0 g·L-1，（NH4）2SO40.6 g·L-1，NaCl 1.0 g·L-1，FeSO·47H2O 0.05 g·L-1，K2HPO40.5g·L-1，MgSO·47H2O 0.25g·L-1，其余为去离子水。

1.1.3 主要试剂与仪器 纳氏试剂购于河南标准物质研发中心；酒石酸钾钠、过硫酸钾、葡萄糖、蔗糖、红糖、可溶性淀粉、硫酸铵、七水合硫酸亚铁、磷酸氢二钾、七水硫酸镁以及其他主要试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。以上药品均为分析纯。DJS-2013R-2恒温摇床购于上海世平实验设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台购于苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；YP30002电子天平购于上海越平科学仪器苏州制造有限公司；UV-5500紫外可见分光光度计购于上海元析仪器有限公司；MLS-3750高压蒸汽灭菌锅购于日本SANYO公司；22331离心机购于德国Eppendorf公司；LBY纯水仪购于北京龙碧源水处理设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种分离纯化和筛选 取渗滤液10 mL，接种于100 mL灭菌后的富集培养基中，充分摇匀，在温度为30℃、转速180 r·min-1的条件下振荡培养，富集7 d，每隔1 d补加0.5 g（NH4）2SO4。富集后经梯度稀释均匀涂布于分离培养基的平板上，在30℃培养箱倒置恒温培养，挑取平板上长出的单菌落进行重复分离纯化，直至得到单一菌株，命名为Z-5。

1.2.2 菌株的分子鉴定 利用TIAGEN真菌试剂盒提取菌株Z-5的DNA，然后以其DNA为模版、以27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）与1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）为引物，采用PCR仪扩增其内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）序列，扩增后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，利用测序结果在NCBI上进行Blast比对，并用MEGA 5.0做系统发育树。

1.2.3 单一因素最优条件试验 将菌株Z-5接种于100 mL筛选培养基中，置于30℃下、180 r·min-1摇床中进行培养，每24 h取样测定其氨氮浓度，其中不同的培养条件设置如下。①不同接种量：接种量分别为0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，氨氮初始浓度为100 mg·L-1，碳源为葡萄糖，pH为6.0，培养时间为5 d；②不同初始氨氮浓度：氨氮浓度分别为100、250、500、750、1 000 mg·L-1，接种量为1%，碳源为葡萄糖，pH为6.0，培养时间为7 d；③不同碳源：碳源分别为葡萄糖、蔗糖、红糖、可溶性淀粉，接种量为1%，氨氮浓度为100 mg·L-1，pH为6.0，培养时间为3 d；④不同pH：pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种量为1%，氨氮初始浓度为100 mg·L-1，碳源为红糖，培养时间为4 d。

1.2.4 正交试验 以100 mg·L-1氨氮为初始氮源，设计L（933）正交试验，3个因素分别为A：氨氮初始浓度；B：碳源；C：pH（表1）。

表1 因素水平表Table 1 The factors and levels scale

1.2.5 氨氮检测方法将待测样品用去离子水稀释到合适的倍数，然后用纳氏试剂分光光度法进行氨氮的测定。氨氮具体测定方法参考Fei等［12］纳氏试剂分光光度法。

2 结果与分析

2.1 菌株的形态特征

观察菌株Z-5在固体分离培养基的菌落形态，该菌株为乳白色圆形，表面不光滑，着生菌丝。增殖后菌株由乳白色转变为红褐色且有菌丝分布于培养基中。该菌属于真菌界，菌株Z-5在光学显微镜下的形态如图1所示，帚状枝双轮生，梗基每轮3～5个；瓶梗每轮4～6个；分生孢子椭圆形，经常呈长链状。

图1 菌株Z-5在光学显微镜下的形态Fig.1 Morphology of strain Z-5 under optical microscope

2.2 菌株的分子鉴定

PCR扩增菌株Z-5的ITS序列在NCBI（http：//archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上进行序列比对，用MEGA 5.0做分子发育树。结果表明，菌株Z-5与褐红篮状真菌（Talaromyces pinophilusKF572452.1）的同源性最高，相似性达到99%，因此初步判断Z-5属于褐红篮状菌（图2）。

图2 菌株Z-5的ITS基因序列系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of ITS gene sequence of Z-5 species

2.3 菌株Z-5降解氨氮能力

2.3.1 接种量对菌株Z-5氨氮降解的影响 由图3可知，当氨氮初始浓度为100 mg·L-1时，在不同的接种量条件下，氨氮降解率均随着时间的增加呈现先快速增加后逐渐平稳的趋势，同时随着接种量的增加氨氮降解率大体呈先增加后减少的趋势，第1、2 d时，随着接种量的增加氨氮降解率呈逐渐增加趋势，第3 d开始接种量1.0%时氨氮降解率升高，并在第5 d时达到峰值，为95.1%。其中接种量为0.1%、0.5%、1.5%、2.0%时均在培养第5 d氨氮降解率达到峰值，分别为79.2%、86.5%、87.8%、81.1%。以上结果表明，菌株Z-5最适的接种量为1%。

图3 接种量对菌株Z-5氨氮降解率的影响Fig.3 Effects of inoculation amount on ammonia degradation rate of Z-5

2.3.2 初始氨氮浓度对菌株Z-5降解氨氮的影响由图4可知，在初始氨氮浓度为100 mg·L-1时，培养2 d氨氮去除率即可达到90%以上，初始氨氮浓度为250、500、750 mg·L-1时，氨氮去除率分别在第3、4、7 d达到90%以上，而当氨氮初始浓度为1 000 mg·L-1时，在培养到第7 d时，氨氮去除率达到69.3%。结果表明，氨氮初始浓度越小，氨氮去除率达到最大所需的时间越短，当氨氮初始浓度为100 mg·L-1时，氨氮去除率于第4 d时达到最高，为96.1%。如图5所示，氨氮初始浓度分别为100、250、500、750、1 000 mg·L-1时，其对应氨氮绝对降解量分别在第2、3、5、7 d时达到最高，分别为96.1、238.2、472.6、702.0、693.1 mg。以上结果说明，氨氮初始浓度越低，氨氮绝对降解量达到最大所需时间越短；初始氨氮浓度在100～750 mg·L-1的范围内时，氨氮初始浓度越高，氨氮绝对降解量的峰值越高，但当氨氮初始浓度提高到1 000 mg·L-1时，其最大氨氮绝对降解量开始下降，因此，菌株Z-5在初始氨氮浓度1 000 mg·L-1以下时，提高氨氮浓度可以提高菌株Z-5的氨氮降解效率。

图4 氨氮初始浓度对菌株Z-5氨氮降解率的影响Fig.4 Effect of initial concentration of ammonia nitrogen on ammonia degradation rate of Z-5

图5 氨氮初始浓度对菌株Z-5氨氮绝对降解量的影响Fig.5 Effect of initial ammonia nitrogen concentration on absolute degradation of ammonia nitrogen by strain Z-5

2.3.3 碳源对菌株Z-5氨氮降解的影响 由图6可知，菌株Z-5最适碳源为红糖，在培养2 d内就可以将氨氮基本完全降解；其次为蔗糖和葡萄糖，在培养3 d后氨氮几乎被完全降解；淀粉作为碳源氨氮降解效果最差，在培养第3 d时氨氮仅去除28.5%。以上结果表明，碳源是微生物生长的能源物质，对微生物的生长发育具有重要作用，合适的碳源不仅能提高氨氮的降解效果，而且能大大降低成本。

图6 碳源对Z-5菌株氨氮浓度的影响Fig.6 Effect of carbon source on ammonia concentration of Z-5

2.3.4 pH对菌株Z-5氨氮降解的影响由图7可知，在不同pH条件下，随着培养时间的增加，氨氮去除率呈先上升后趋于平稳的趋势。菌株在pH 6.0～8.0时均能很好地发挥脱氮作用，在第4天时其去除率分别为94.97%、94.91%、94.75%，其中当初始pH为8.0时其氨氮去除率在第3天时已达到90.66%，以上结果表明，该菌株更适合中性偏碱的环境，但是在弱酸环境时仍然具有较好的降解效果。

图7 pH对Z-5菌株氨氮降解率的影响Fig.7 Effect of pH on ammonia degradation rate of Z-5

2.4 单因素交叉响应

上述每个单因素指标的计算结果具有片面性，无法表现多种因素的相互影响。为探索多因素的相互影响，用磷酸盐缓冲液和HCl或NaOH调节不同酸碱度和氨氮初始浓度之间的相互影响为例，分析双因素对氨氮降解率的影响，其交互作用的响应面如图8所示，菌株Z-5的初始pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和初始氨氮浓度（100、250、500、750、1000 mg·L-1）的二元分布共包含5×5＝25组结构组合，从图中可以看出，随着pH的增加，不同初始氨氮浓度对应的氨氮降解率均先增加，到达最大值后再依次减小；随着初始氨氮浓度的增加，不同pH对应的氨氮降解率均依次减小，并且当初始氨氮浓度为100 mg·L-1和pH为7.0时，其氨氮降解率最高，达到了96.3%，与探究单因素菌株Z-5降解氨氮效果的结果一致。综合单因素的实验结果分析，影响氨氮降解的几个因素主要是氨氮初始浓度、碳源以及pH，故以氨氮降解率为指标，做初始浓度、碳源和pH 3因素3水平正交试验L9（33），正交试验结果见表2。由表2可知，各因素对氨氮降解率的影响主次顺序分别为：氨氮初始浓度、碳源、pH，最优水平为A1B3C3，即氨氮初始浓度为100 mg·L-1，碳源为红糖，pH为7.0，氨氮降解率达到了94.75%。

图8 pH和氨氮初始浓度之间的二元分布Fig.8 Bivariate distribution of pH and initial concentration of ammonia nitrogen

表2 正交试验结果Table 2 The results of orthogonal experiments

3 讨论

研究表明，含有高浓度氨氮的废水如果不经处理直接排放到水库或江河湖海中，会影响人类健康，并且过量的氨氮会破坏水体自净能力，打乱水体环境生态平衡［20］。本研究结果表明，菌株Z-5最适接种量为1.0%，分析原因为，接种量的大小决定了菌种的繁殖速度，接种量过大或过小，都会影响氨氮降解效果。接种量过大会造成溶氧不足，影响产物的合成，随之产生更多的代谢中间产物，不利于菌株生长；过小会延长培养时间，影响氨氮降解速率。吴建江等［21］筛选出一株假单胞菌（Pseudomonassp.）XS76，其最适接种量为4%；王田野等［22］筛选出的一株异养硝化好氧反硝化菌不动杆菌（Acinetobactersp.）SQ2，研究发现其最适接种量为5%。适宜的氨氮浓度可以促进氨氧化菌的生长，提高氨氮去除效率，但过高的氨氮，会抑制氨氧化菌的生长与活性，从而影响其氨氮降解能力［16］。，随着氨氮浓度的增加，菌株Z-5对污水氨氮去除率逐渐下降，在初始氨氮浓度100～750 mg·L-1的范围内，菌株Z-5对氨氮的绝对去除量逐渐增加。分析原因为，氨氮浓度的提高可能会导致C/N比下降造成的；菌株Z-5的最适碳源为红糖，不同的碳源对菌株的氨氮降解能力不同，本研究的碳源分别是葡萄糖、蔗糖、红糖和淀粉，其中葡萄糖、蔗糖和淀粉均属于化合物，而红糖为混合物，总糖分≥85%，含有较多微量元素，如铁、锌、锰、铬等，这些微量元素为菌株降解氨氮的过程中提供了营养物质；菌株Z-5最适pH为7.0，即在中性条件下氨氮降解能力最强。有研究表明，香茅醇假单胞菌（Pseudomonas）WXP-4［9］和寡养不动杆菌（Acinetobactersp.）SYF26［23］pH为7.0时脱氮能力最佳，而喻其林等［24］、朱伟等［25］在鸡粪和生活污水中分离的微生物最适pH分别为7.5、8.0，表明微生物生存环境不同，筛选出的菌种最适pH也存在明显的差异。

本研究对筛选菌株Z-5氨氮降解特性作了初步单因素分析、二元分布以及3因素3水平正交试验，结果表明，当接种量为1%、氨氮初始浓度为100 mg·L-1、碳源为红糖以及pH为7.0时，氨氮降解率最高，达到了94.75%。综上所述，菌株Z-5对低浓度的氨氮具有较高的去除能力，在培养时长足够的条件下对高氨氮废水也具有较强的去除能力，本研究结果为菌株Z-5在实际废水处理中的应用奠定了理论基础，但其他环境影响因素以及多因素交叉影响情况有待进一步分析。