脑卒中患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷临床疗效研究

韩瑞玲，李艳

脑卒中患者CYP2C19基因多态性与氯吡格雷临床疗效研究

韩瑞玲，李艳

目的：探讨武汉地区部分脑卒中患者氯吡格雷代谢相关CYP2C19基因多态性与氯吡格雷临床疗效的关系。方法：选取武汉大学人民医院神经内科收治的脑卒中患者292例，采用光比浊法检测患者服用氯吡格雷前后的血小板聚集率，计算其血小板抑制率；采用基因芯片法测定患者的CYP2C19基因（*1，*2和*3），并将患者按照基因检测结果分为不同代谢类型：快代谢型（*1/*1），中间代谢型（*1/*2和*1/*3）及慢代谢型（*2/ *2，*2/*3和*3/*3）。采用统计学方法分析CYP2C19不同代谢类型患者血小板抑制率的差异。结果：根据CYP2C19基因多态性位点进行代谢分型，快代谢型占37.33%，中间代谢型占46.92%，慢代谢型占15.75%。3种代谢类型患者服用氯吡格雷前后的血小板抑制率分别为（54.39±18.93）%，（30.02±21.53）%及（10.34± 3.83）%，3种代谢型患者之间血小板抑制率比较均有统计学意义，其中快代谢型患者显著高于中间代谢型和慢代谢型患者（P<0.05）。结论：脑卒中患者中CYP2C19*2、*3基因变异者使用氯吡格雷抗凝的疗效较差，测定CYP2C19基因型对于脑卒中患者使用氯吡格雷治疗可能具有重要的指导意义。

脑卒中；CYP2C19基因；基因多态性；氯吡格雷；血小板抑制率

新型抗血小板药物氯吡格雷与阿司匹林的联合应用已成为中国脑血管病专家共同推荐的抗栓治疗的首选药物，广泛应用于急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke, AIS）患者[1]。氯吡格雷必须在体内经过以CYP2C19为主的肝脏细胞色素P450酶同工酶家族代谢成为活性产物，才能有效拮抗二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受体，抑制ADP对血小板的诱导作用，抗血小板聚集[2]。但部分患者对氯吡格雷存在低反应或无反应性，长期服用常规剂量的氯吡格雷（75 mg）仍不能有效抑制血小板聚集，此现象称为氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）[3]。本研究旨在通过分析脑卒中患者CYP2C19基因型与血小板抑制率之间的关系，探讨CYP2C19基因多态性与氯吡格雷临床疗效的关系，并为进一步研究打下基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2014年6月至2015年12月在武汉大学人民医院神经内科住院，诊断为缺血性脑卒中、拟进行血管内治疗并以氯吡格雷治疗的湖北籍无血缘关系的患者292例，男性153例，女性139例；年龄39～81岁，平均（61.1±12.59）岁；病程8～75 h，平均（27.3±15.9）h；所有患者均为汉族，均否认家族遗传病病史。纳入标准：首次发病；符合2014年中华医学会神经病学分会修订的中国急性缺血性脑卒中诊治指南规定[4]，并通过CT或MRI证实；美国国立卫生院脑卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）评分≥3分；采用双联抗血小板疗法，首次负荷剂量口服阿司匹林及氯吡格雷均为300 mg/d，后改为阿司匹林100 mg/d，氯吡格雷75 mg/d，且口服氯吡格雷75 mg≥7 d。排除标准：严重心功能不全者；严重肝肾功能损害者；患有内分泌、免疫系统疾病者；近期有出血史或者肝素诱发血小板减少患者；合并使用地西泮、奥美拉唑质子泵抑制剂等经CYP2C19酶代谢的药物者。

1.2 方法

1.2.1 试剂和仪器 BR-526-24全自动杂交仪、BE2.0生物芯片识读仪，购于上海百傲科技有限公司；T100 PCR仪购于美国Bio-rad公司，PACKS-4四通道血小板聚集及基质分析仪购于美国Helena公司。全血基因组DNA提取试剂盒、CYP2C19基因检测DNA微阵列芯片法试剂盒购于上海百傲科技有限公司、ADP购于美国Helena公司。

1.2.1 血小板聚集抑制率分析 所有研究对象在双重抗血小板治疗前和治疗7 d后采集静脉血4～5 mL（枸橼酸钠抗凝），采用光学比浊法测定5 μmol/LADP诱导的血小板聚集率。采用HemoRAM分析系统计算血小板聚集率。血小板聚集抑制率%=（治疗前血小板聚集率-治疗后血小板聚集率）/治疗前血小板聚集率× 100%。血小板聚集抑制率＞10%被认为对氯吡格雷敏感，血小板聚集抑制率≤10%时被认为氯吡格雷反应低下，即氯吡格雷抵抗[5]。

1.2.2 CYP2C19基因分型检测[6]患者于血管内治疗前静脉采血1～2 mL（EDTA管抽取，4℃存放），按照试剂盒说明书进行DNA提取和纯化及PCR扩增。将PCR产物在BR-526-24全自动杂交仪上进行杂交及显色。采用BE2.0生物芯片识读仪及V2.0基因芯片图像分析软件进行图像扫描与数据分析，分别检测CYP2C19的636G、636A、681G、681A等位基因。根据分型检测结果，将CYP2C19野生纯合子*1/*1（636GG/ 681GG）定义为快代谢型（正常代谢型），单突变型1/*2和*1/*3定义为中间代谢型，纯合子突变型*2/*2（636GG/681AA）、*3/*3（636AA/681GG）及杂合子双突变型*2/*3（636GA/681GA）定义为慢代谢型。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理数据，计量资料以（χ±s）表示，正态分布样本组间比较采用单因素方差分析；计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；Hardy-Weinberg平衡定律计算各等位基因频率分布数据的可靠性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各等位基因的频率符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=0.076，P=0.781），提示被测群体基因遗传平衡。CYP2C19基因型采用生物芯片法判读并分类，本组患者中间代谢型比例略高于快代谢型，见表1。服用氯吡格雷后，快、中代谢型组血小板抑制率显著高于慢代谢型组（P＜0.05），快代谢型组显著高于中代谢型组（P＜0.05），见表2。快代谢型组血小板抑制率的分布与慢代谢型组相比具有显著性差异（χ2=5.04，P=0.025），而与中间代谢型组相比无统计学差异（χ2=0.69，P= 0.406）。

表1 本组脑卒中患者CYP2C19基因型分布

表2 本组不同代谢型脑卒中患者血小板抑制率及分布[n(%)]

3 讨论

噻吩吡啶类衍生物氯吡格雷在血管性疾病中抗血小板聚集的重要辅助治疗作用已得到证实。国内外研究表明，编码氯吡格雷代谢相关CYP2C19酶的等位基因主要是*1，*2和*3型，其中*2和*3变异也称缺失功能等位基因（loss-of-function alleles，LOF alleles），会导致氯吡格雷抵抗，使CYP2C19酶催化活性降低，氯吡格雷代谢减弱，从而导致其抗血小板作用减弱，影响氯吡格雷的疗效及安全性[7,8]。其中*2位点突变所导致的缺血缺氧性心脑血管事件或1年内死亡率的风险比高达2.42[9,10]。

本研究将受试患者按照CYP2C19基因型别分为快、中、慢代谢型3组，结果显示，拟行血管内治疗的脑卒中患者的CYP2C19基因多态性分布中，具有多态性的中间代谢型和慢代谢型占62.7%，这与国内外相关报道的亚洲人群约50%～60%突变率相似[11-13]。但本研究各代谢型的分布与报道略有不同，表现为中间代谢型略高、弱代谢型略低，这些差异与研究对象的纳入标准、遗传背景及研究例数等的差异有关，亦提示我们需要进行更大样本的抽样研究，建立更为科学的统计分析方法，从多因素，如年龄、性别、体重、吸烟史及其他病史（糖尿病、高血压、高脂血症、心绞痛等）、合并用药（β-受体阻滞剂类、他汀类）等进行综合分析，才能取得更有参考价值的临床资料。此外，本研究中不同代谢类型的脑卒中患者之间血小板抑制率具有显著性差异，携带有1个或2个*2或/和*3基因的中间代谢型和慢代谢型患者，该基因编码的CYP2C19酶的代谢功能降低，导致氯吡格雷代谢活性降低，血小板抑制率均显著性低于无突变基因的快代谢型患者，提示*2和*3变异将导致氯吡格雷临床疗效降低，这与其他文献报道相符[14-16]。根据文献报道[5]，血小板抑制率＜10%时患者对氯吡格雷不敏感，抗血小板聚集效果不佳，会导致血栓事件。本研究中，慢代谢患者血小板抑制率＜10%者占58.7%，与快代谢组相比具有显著性差异，提示CYP2C19基因多态性与氯吡格雷抵抗存在关联。

总之，本研究表明武汉地区部分脑卒中患者中CYP2C19基因多态性与氯吡格雷的临床疗效具有一定相关性，CYP2C19*2、*3基因变异者使用氯吡格雷抗凝的疗效较差，临床医务工作者可根据患者的CYP2C19基因型调整氯吡格雷用药剂量或更换为其他抗血小板药物，以达到优化个体化用药的目的，改善患者的预后。

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（本文编辑：唐颖馨）

Study on the CYP2C19 Gene Polymorphism and Clinical Efficacy of Clopidogrel in Patients with Stroke

HANRui-ling,LIYan.Department ofClinical Laboratory,RenminHospital ofWuhanUniversity,Wuhan,430060，China

Objective:To screen for the relationship between clopidogrel metabolism related gene CYP2C19 polymorphism and clinical efficacy of clopidogrel in patients with stroke.Methods:Two hundred and ninety-two patients with stroke treated with clopidogrel,hospitalized in the department of neurology of Renmin hospital of Wuhan university were selected as research objects.The platelet aggregation in patients before and after clopidogrel treatment was measured by optical aggregometry method in order to calculate the platelet inhibition rate. CYP2C19 genotypes(*l,*2,*3)were detected by gene chip method.According to the genotypes,all patients were divided into three different types of metabolism:fast metabolizer type(*1/*1),intermediate metabolizer types(*1/*2,*1/*3)and slow metabolizer types(*2/*2,*3/*3,*2/*3).The differences of platelet inhibition rates were analyzed by statistical methods among different types of metabolisms.Results:According to the classification of CYP2C19 gene polymorphism of metabolic function,patients of fast metabolism type accounted for 37.33%,while patients of intermediary metabolism type and slow metabolism type accounted of 46.92%and 15.75%,respectively.The platelet inhibition rate of the three metabolic types was（54.39±18.93）%,（30.02± 21.53）%and（10.34±3.83）%,respectively.There was statistical significance among the three metabolic types, and platelet inhibition rate of fast metabolic patients was significantly higher than intermediate metabolic and poor metabolic patients(P<0.05).Conclusion:The clinic therapeutic effect of clopidogrel in patients with*2 and *3 polymorphism was poor.Genotyping of CYP2C19 could be helpful in guiding individualized medication of clopidogrel in patients with stroke.

stroke;CYP2C19 gene;gene polymorphism;clopidogrel;platelet inhibition rate

R741;R741.05;R743

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.004

武汉大学人民医院检验科武汉 430060

国家自然科学基金（No.81501427）

2016-03-25

李艳yanlitf1120@163. com