p-JNK/p-c-Jun通路参与大鼠杏仁核点燃癫痫模型

李巷，潘建青，康慧聪，杨志刚，韩金玲，聂荔，肖小华，张玲玲，朱遂强

p-JNK/p-c-Jun通路参与大鼠杏仁核点燃癫痫模型

李巷1，潘建青1，康慧聪2，杨志刚1，韩金玲1，聂荔1，肖小华3，张玲玲1，朱遂强2

目的：研究杏仁核点燃癫痫模型中c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路的活化。方法：雄性Wistar大鼠20只，随机分为对照组10只和模型组10只。将电极植入大鼠右侧杏仁核，对照组不给予电刺激，模型组每天给予500 μA的电流刺激，大鼠连续10 d在刺激后达到5级发作视为点燃成功。成功点燃的大鼠，在最后1次5级发作后2 h处死。Western blot检测2组海马JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun的表达。结果：模型组刺激侧海马p-JNK、p-c-Jun表达明显高于对照组（P＜0.05）。结论：p-JNK/p-c-Jun通路可能参与杏仁核癫痫模型点燃。

杏仁核点燃；磷酸化JNK；磷酸化c-Jun

颞叶癫痫及其动物模型主要的病理变化是海马硬化，包括神经元缺失及胶质细胞增生[1]。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）又被称为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase,SAPK），是丝裂原活化蛋白激酶系统成员之一，参与细胞生长、分化等的调控。JNK激活参与多种癫痫动物模型，与神经元凋亡相关。JNK可通过一系列磷酸化级联反应激活。活化的JNK可调控细胞核底物如c-jun等，促进细胞凋亡[2]。杏仁核点燃模型是目前国际公认的一种更为接近人类、应用广泛的复杂部分性发作模型。本课题组前期研究已发现，杏仁核点燃模型中刺激侧海马免疫组化染色有p-JNK表达，并与神经元损害部位一致。本研究定量检测刺激侧海马JNK/p-JNK及其下游信号c-jun/p-c-jun的表达，进一步阐述点燃模型海马损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠20只，体质量250～300 g。标准实验条件饲养。1.1.2主要试剂 兔抗JNK多克隆抗体及兔抗p-JNK多克隆抗体购自美国Cell Signal公司，小鼠抗p-c-Jun多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，HRP标记羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术公司，小鼠抗β-actin单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制作及分组6%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，固定于立体定位仪上，将自制五芯电极中的刺激电极植入右侧杏仁核基底外侧核（前囟后2.2 mm,旁开右侧4.8 mm，颅骨表面下8.5 mm）[4]。其他3个电极分别接上微型螺丝，置于前囟点左右及人字缝后方作为记录电极和参考电极。牙托粉固定。将所有大鼠随机分为对照组和模型组，各10只。2组均手术植入电极，术后1周，对照组每天抓取，但不予电刺激；模型组每天同一时间予电刺激：细电流，连续串刺激，延时100 ms，波宽1 ms，波间隔19 ms，频率50 Hz，串长100，方波，刺激强度500 μA，1次/d。刺激后记录大鼠行为学变化。发作强度参照国际通用的Racine分级，并参考以往研究[3]。连续10天达到5级发作视为模型点燃。最后1次5级发作2 h取标本。

1.2.2 Western blot检测 提取海马组织蛋白，测定蛋白浓度后，行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，加一抗、二抗孵育，DAB显色，扫描胶片，使用美国Gene Genius公司凝胶成像分析系统分析JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun及β-actin光密度值。

1.2.3 组织学变化 制备脑组织冰冻切片，尼氏染色后中性树胶封片，镜下观察电极位置是否正确，有无异常出血及组织损害。有以上情况出现的大鼠实验数据予以剔除。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件处理数据，计量资料以（χ±s）表示，组间比较采用独立样本均数t检验，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

Westernblot结果显示，2组p-JNK46/54均有表达，模型组蛋白表达量明显增多；相对光密度值分析示：对照组、模型组中p-JNK46/actin分别为（0.24±0.02）、（0.48±0.01），p-JNK54/actin分别为（0.26±0.02）、（0.50± 0.03），差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B；JNK在2组中均有大量表达，但差异无统计学意义。p-c-Jun在2组均有表达，相对光密度值分析示：对照组、模型组中p-c-Jun分别为（0.38±0.03）、（0.88±0.02），差异有统计学意义（P＜0.05），见图2B；c-Jun在2组中均有大量表达，但差异无统计学意义。

模型组1只大鼠点燃不成功，电极脱落，其他大鼠点燃后均表现出稳定的5级发作。对照组大鼠无电极脱落。

3 讨论

研究发现，在成功点燃的模型中，刺激侧海马p-JNK表达明显增多，与前期研究海马神经元损伤部位基本一致；刺激侧海马p-c-Jun表达明显增多；提示杏仁核点燃模型可能是通过p-JNK激活c-Jun致p-c-Jun表达增多，参与海马神经元损伤。

图1 对照组与模型组JNK与p-JNK变化

图2 对照组与模型组c-jun与p-c-jun变化

JNK的编码基因有3个，JNK1/2广泛存在于体内各种组织，JNK3主要分布在脑组织[4]，通过磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基来活化。各种促炎反应因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β，细胞应激如热休克、紫外线照射、氧化应激都可以激活JNK[5]。JNK激活参与了多种癫痫动物模型，在毛果芸香碱导致的癫痫持续状态早期即有JNK的激活，且广泛分布于边缘系统，与神经元损伤区域分布一致[6]；海人酸癫痫大鼠模型中，注射海人酸30 min即开始出现JNK激活，持续2 h恢复正常，同时JNK的底物c-jun磷酸化增强，参与神经元损伤[7]。JNK1及c-jun活化参与电休克惊厥[8]；戊四氮小鼠癫痫模型中磷酸化JNK、磷酸化c-jun及上游信号MKK4均表达增多[9]。海马快速电点燃模型中，胶质细胞介导了JNK的活化并参与神经元的损伤过程[10]。上述实验均证实了JNK信号转导系统参与了急性癫痫发作及神经元损伤，但对于长期癫痫发作JNK通路是否参与研究较少。本实验中，杏仁核低强度电流刺激点燃模型是一个长期慢性的过程，大鼠完全点燃持续15～20 d，与对照组相比，模型组刺激侧海马p-JNK及p-c-Jun表达明显增多，与其他癫痫模型报道一致。

JNK活化后主要通过2个途径参与细胞损伤：一方面，转移至细胞核内，激活转录因子c-jun，进而增加AP-1转录及细胞凋亡；另一方面，一部分激活的JNK留在胞质中，参与Bcl-2家族成员的活化，最终导致细胞凋亡。本实验中刺激侧海马p-JNK及p-c-Jun表达明显增多，说明活化的JNK可进一步激活c-jun参与模型点燃。实验还需进一步研究其他可能的途径（如Bcl-2家族成员），进一步阐明杏仁核点燃的分子机制。

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（本文编辑：唐颖馨）

Involvement of p-JNK/p-c-Jun signalingin Amygdala-kindled Seizures

LIXiang1,PANJi-an-qing1,KANGHui-cong2,YANGZhi-gang1,HANJin-ling1,NIELi1,XIAOXiao-hua3,ZHANGLing-ling1, ZHUSui-qiang2

1.Departmentofneurology,NanshanHospital，Shenzhen,Guangdong,518052,China;2.Department ofNeurology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,430030,China;3.DepartmentofNeurology,SecondPeople’sHospital,Shenzhen,Guangdong, 518052,China

Objective:To evaluate the involement of JNK mitogen-activated protein kinase signaling pathway in amygdala-kindled models.Methods:Twenty Wistar rats were randomly divided into control group(n=10) and kindling group(n=10).Electrodes were implanted into the right amygdala of all the rats.Kindling was accomplished using stimulus strength of 500 μA applied daily to the amygdala until stage 5 were induced in rats for consecutive 10 days.All kindled rats were decapitated 2 h after the tenth stage 5 seizures.Rats in the control group did not receive stimulus.Western blot were performed to test the expression of JNK,p-JNK,c-Jun，p-c-Jun in hippocampus.Results:Kindling increased the expression of p-JNK and p-c-Jun in amygdala-kindled models. The difference is statistical significant between control group and kildling group.Conclusion:p-JNK/p-c-Jun signaling may be involved in amygdala-kindled seizures.

amygdala-kindled;p-JNK;p-c-Jun

R741;R742.1

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.002

1.深圳市南山区人民医院神经内科广东 深圳518052

2.华中科技大学统计医学院附属同济医院神经内科武汉 430030

3.深圳市第二人民医院广东 深圳518052

国家自然科学基金青年基金（No.81201006）湖北省自然科学基金（No.2011CDB201）深圳市南山区技术研发和创意设计项目分项基金（No.南 科 研 卫2012002）深圳市南山区技术研发和创意设计项目分项基金（No.南 科 研 卫2014015）深圳市科技计划项目（No.JCYJ20140414 170821276）

2016-01-26

朱遂强zhusuiqiang@163. com