TSG-6对脑出血大鼠血脑屏障的保护作用

李东辉

TSG-6对脑出血大鼠血脑屏障的保护作用

李东辉

目的：探讨肿瘤坏死因子α刺激基因6因子（TSG-6）对脑出血大鼠血脑屏障的保护作用及对Claudin-5和ZO-1表达的影响。方法：大鼠108只，随机分为对照组12只、模型组48只和TSG-6组48只。大鼠自体动脉血注射制备脑出血模型，分光光度法检测各组出血侧和未出血侧大脑皮质及海马组织中伊文思蓝（EB）浓度，Western Blotting检测出血侧和未出血侧大脑皮质及海马组织中Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平。结果：干预后4 h、1 d、3 d和7 d，模型组和TSG-6组出血侧大脑皮质和海马组织中EB浓度高于对照组（P<0.05）；模型组和TSG-6组出血侧大脑皮质和海马组织中Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平低于对照组（P<0.05）；TSG-6组出血侧大脑皮质和海马组织中EB浓度低于模型组（P<0.05）；TSG-6组出血侧大脑皮质和海马组织中Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平高于对照组（P<0.05）；TSG-6组和模型组未出血侧大脑皮质和海马组织中的EB浓度、Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平与对照组没有显著性差异（P>0.05）。结论：TSG-6对脑出血大鼠的血脑屏障有保护作用，其作用机制可能与升高血脑屏障中的紧密连接蛋白Claudin-5和ZO-1的表达水平有关。

肿瘤坏死因子α刺激基因6因子；脑出血；Claudin-5；ZO-1

血脑屏障损伤后，血脑屏障的通透性显著增加，导致外周血液中的各种炎性因子和炎性细胞进入大脑，从而严重损伤大脑[1-3]。肿瘤坏死因子α刺激基因6因子（tumornecrosis factor alpha-stimulated gene-6，TSG-6）是近些年来新发现的一种抗炎活性细胞因子，可抑制炎性因子的合成分泌以及抑制炎性细胞的浸润[4]。另有研究表明血脑屏障通透性的异常增加与血脑屏障中的紧密连接复合体的异常变化有关，Clandin-5和ZO-1是紧密连接复合体重要的组成部分[5,6]。本文观察外源性TSG-6对脑出血大鼠血脑屏障的保护作用及对紧密连接蛋白Claudin-5和ZO-1的影响，为治疗脑出血提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠108只，体质量220～260 g，购自安徽省实验动物中心，许可证编号为SCXK（皖）2015-004。将108只大鼠随机分为对照组12只、模型组48只和TSG-6组48只。

1.1.2 主要试剂及仪器TSG-6（购于上海碧云天生物技术公司）、伊文思蓝（Evans Blue，EB，购于美国Sigma公司）、Claudin-5和ZO-1兔抗鼠多克隆抗体（购于美国Bioworlde公司），紫外分光光度仪（购于美国Beckman公司）、低温离心机（购于日本日立公司）、低温冰箱（购于中国海尔公司）、电泳仪（购于美国Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脑出血模型制备及各组处理 使用自体血注入法复制大鼠脑出血模型。将大鼠适应性喂养1周，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后置于立体定位仪，头皮正中切口，右侧颅骨钻孔（中线旁开3 mm，前囟前0.2 mm）。剪断大鼠尾巴2～3 cm，用试管采血，压迫断端并包扎，微量注射器抽取50 μL未凝血，将微量注射器插入脑组织，深度为6.0 mm，向右侧尾状核缓慢注入自体血，尽量减少反流。然后缓慢移出，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮并消毒[7]。对照组大鼠不做任何处理。对造模完成的大鼠腹腔注射头孢菌素，在笼中进行饲养。造模后，TSG-6组立即从尾静脉注射含TSG-6的PBS溶液（100 μg/100 g）；模型组和对照组从尾静脉注射PBS溶液，剂量为100 μL/100 g。模型组和TSG-6组分别在干预4 h、1 d、3 d和7 d后各处死12只，对照组在造模后第7天后处死。

1.2.2 血脑屏障通透性评估 每组各6只大鼠，在处死前1 h通过尾静脉注入2%的EB（0.3 mL/100 g），处死大鼠，将生理盐水从左心室灌注，直至右耳有清亮液体流出。分别取出血侧和健侧大脑的皮质及海马组织，用分析天平进行精密称重，将称重后的皮质和海马组织放在容量为5 mL的二甲基甲酰胺溶液试管中，37℃水浴48 h，将水浴后的皮质和海马组织在离心机中进行离心并收集上清液，3 000 rpm、离心15 min，采用分光光度法检测上清液中EB在632 nm波长处的最大吸光度，然后在根据EB的标准曲线计算出不同大脑皮质和海马组织中的EB含量。

1.2.3 大鼠脑组织中Clandin-5和ZO-1的检测 每组各6只大鼠，分别取出血侧和健侧大脑的皮质和海马组织，加入适量裂解液，在低温的条件性使用玻璃匀浆器对皮质和海马组织进行匀浆，4℃、12 000 rpm，离心5 min，吸取上清液，加入适量的上样缓冲液水煮后用凝胶电泳仪对总蛋白进行分离，将目的蛋白转膜至NC醋酸纤维素膜上，在5%脱脂奶粉溶液中封闭1 h，3次洗膜，加入Claudin-5和ZO-1兔抗鼠多克隆抗体4℃孵育过夜，3次漂洗，在辣根过氧化物酶标记的二抗中常温下孵育2 h，3次洗膜，涂抹ECL发光试剂，暗室内曝光，拍照，分析目的蛋白和内参蛋白的灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件处理数据，计量资料以（χ±s）表示，重复测量和多变量方差分析、单因素方差分析、LSD检验法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脑屏障通透性变化比较

干预后4 h、1 d、3 d和7 d，模型组和TSG-6组的脑组织中的EB浓度较对照组增加，有显著性差异（P< 0.01）；TSG-6组的脑组织中的EB浓度低于模型组，有显著性差异（P<0.01）；健侧的大脑皮质和海马组织中的EB浓度和对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见表1-4。

2.2 各组大鼠脑组织中Claudin-5表达水平比较

干预后4 h、1 d、3 d和7 d，模型组和TSG-6组的Claudin-5表达水平较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；TSG-6组的Claudin-5表达水平高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；健侧的大脑皮质和海马组织中的Claudin-5表达水平和对照组相比差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.3 各组大鼠脑组织中紧密连接蛋白ZO-1表达水平比较

第4小时、第1天、第3天和第7天中模型组和TSG-6组的ZO-1表达水平较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；TSG-6组在第4小时、第1、3和7天的ZO-1表达水平均高于模型组，差异有统计学意义（P< 0.05）；TSG-6组的健侧的大脑皮质和海马组织中的ZO-1表达水平和对照组比较差异无统计学意义（P> 0.05），见图2。

表1 各组大鼠出血侧大脑皮质中EB浓度比较（μg/g，χ±s）

表2 各组大鼠出血侧大脑海马组织中EB浓度比较（μg/g，χ±s）

表3 各组大鼠健侧大脑皮质中EB浓度比较（μg/g，χ±s）

表4 各组大鼠健侧大脑海马组织中EB浓度比较（μg/g，χ±s）

3 讨论

TSG-6是最新研究发现的一种具有抗炎作用的活性细胞因子，研究发现TSG-6在多种炎性病理变化中具有抗炎和细胞外基质重构的作用。郭艳等[8]研究表明，给予脑梗死大鼠外源性TSG-6，可显著减缓脑梗死所导致的血脑屏障通透性增加、缩小脑梗死面积、改善神经功能损伤。Watanabe等[9]研究发现，TSG-6减轻脑梗死大鼠血脑屏障通透性的作用机制可能是因为抑制基质金属蛋白9表达，并减轻中性粒细胞的浸润程度。本研究发现对脑出血大鼠给予外源性TSG-6可显著降低出血侧大脑皮质和海马组织血脑屏障的通透性，同时对未出血侧大脑皮质和海马组织的血脑屏障的通透性没有影响，这说明TSG-6对脑出血大鼠的血脑屏障有显著的保护作用。

血脑屏障中的第一道屏障由毛细血管内皮细胞和毛细血管之间的紧密连接复合体组成，研究认为血脑屏障通透性调控的关键点是紧密连接复合体的活性变化[10,11]。跨膜蛋白是紧密连接复合体重要的组成部分之一，跨膜蛋白的外部和邻近的跨膜蛋白相互连接，内部和细胞质附着蛋白相互连接。Claudin-5和ZO-1是血脑屏障中重要的紧密连接蛋白。其中ZO-1在黏附连接和紧密连接上都有表达，在组成细胞紧密连接中起重要作用，ZO-1表达水平的变化和血脑屏障通透性的变化联系紧密[12]。陈铎等[13]研究认为，Claudin-5是调控血脑屏障通透性非常重要的活性蛋白，脑梗死大鼠血脑屏障的通透性显著增加，并且可能与Claudin-5和ZO-1表达水平显著性下降有关。本研究发现，TSG-6组和模型组损伤侧的大脑皮质和海马组织中的Claudin-5和ZO-1表达量显著高于对照组损伤侧的Claudin-5和ZO-1表达量；TSG-6组损伤侧的大脑皮质和海马组织中的Claudin-5和ZO-1表达较对照组高且较模型组低，表明TSG-6对出血大鼠的血脑屏障有一定的保护作用，但不能完全恢复造模对血脑屏障所造成的损伤。脑出血大鼠损伤侧的大脑皮质和海马组织中的Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平均显著下降，出血侧大脑皮质和海马组织中的Claudin-5和ZO-1蛋白表达水平没有下降，外源性给予大鼠TSG-6后出血侧大脑皮质和海马组织中的Claudin-5和ZO-1蛋白表达下降的程度会显著降低。这说明TSG-6对脑出血大鼠血脑屏障保护作用的作用机制可能与升高血脑屏障中紧

图1 各组大鼠脑组织中Claudin-5表达水平比较（n=6）

图2 各组大鼠脑组织中ZO-1表达水平比较（n=6）

密连接蛋白Claudin-5和ZO-1表达水平有关。

综上所述，TSG-6对脑出血大鼠的血脑屏障有保护作用，可以降低血脑屏障通透性，其保护作用机制可能与升高血脑屏障中的紧密连接蛋白Claudin-5和ZO-1的表达水平有关。

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（本文编辑：王晶）

Effect of TSG-6 on Blood-brain Barrier Permeability in Cerebral Hemorrhage RatsLI

Dong-hui.Department ofPediatrics,HezePeonyPeople'sHospital,Shandong274000,China

Objective:To explore the effect of TSG-6 on blood-brain barrier permeability and expression of Claudin-5 and ZO-1 in cerebral hemorrhage rats.Methods:Total 108 rats were divided into groups control(n= 12),model(n=48)and TSG-6(n=48).Brain trauma model was induced by hydraulic shock method.Evans blue (EB)tissue concentration in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side and not bleeding side were detected by Spectrophotometry.Claudin-5 and ZO-1 protein levels in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side and not bleeding side were detected by Western Blotting.Results:After 4 h,1 d,3 d,7 d,EB concentration in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of Model group and TSG-6 group were significantly higher than the control group(P<0.05).Claudin-5 and ZO-1 protein levels in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of Model group and TSG-6 group were significantly lower than the control group(P<0.05).EB concentration in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of TSG-6 group was significantly lower than the Model group(P<0.05).Claudin-5 and ZO-1 protein levels in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of TSG-6 group were significantly lower than the Model group(P<0.05).The EB concentration,Claudin-5 and ZO-1 protein levels in not bleeding side of Model group and TSG-6 group were noe significantly different from the control group(P>0.05).Conclusion:The BBB on traumatic brain injury in rats is protected by TSG-6.The mechanism may be elevated in the blood-brain barrier tight junction protein Claudin-5 and ZO-1.

TSG-6;cerebral hemorrhage;Claudin-5;ZO-1

R741;R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.003

菏泽市牡丹人民医院儿科山东 菏泽274000

2015-10-29

李东辉291280451@qq. com