FrzA基因转导干预对大鼠体外缺血缺氧心肌细胞Wnt信号通路相关分子表达及细胞凋亡的影响

李华垠，陶静，马依彤，刘芬，陈邦党

(1新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054；2新疆心血管病研究重点实验室)



FrzA基因转导干预对大鼠体外缺血缺氧心肌细胞Wnt信号通路相关分子表达及细胞凋亡的影响

李华垠1，2，陶静1,2，马依彤1,2，刘芬2，陈邦党2

(1新疆医科大学第一附属医院，乌鲁木齐 830054；2新疆心血管病研究重点实验室)

目的探讨重组9型腺相关病毒(rAAV9)携带FrzA基因转导对心肌细胞缺血缺氧模型Wnt信号通路活性的抑制作用及心肌细胞凋亡的影响。方法 分离培养SD大鼠心肌细胞，将rAAV9携带FrzA基因转导至心肌细胞，在rAAV9表达高峰时建立心肌细胞缺血缺氧模型。随机分为空白组、缺血缺氧组、缺血缺氧+rAAV9-CMV-eGFP组(空病毒组)、缺血缺氧+rAAV9-CMV-FrzA组 (FrzA组)。采用RT-PCR检测各组心肌目的基因FrzA的表达；Western blotting 测定心肌细胞Wnt信号通路关键分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc水平及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果rAAV9转染第5天，目的基因FrzA在心肌细胞中高表达(P<0.05)。缺血缺氧组、空病毒组、FrzA组Wnt信号通路关键分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表达及凋亡蛋白Bax/Bcl-2值较空白组明显升高(P均<0.05)。FrzA组心肌细胞中Wnt信号通路关键分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表达及凋亡蛋白Bax/Bcl-2值低于缺血缺氧组、空病毒组(P均<0.05)。结论 rAAV9介导的FrzA基因转导可有效干预Wnt信号通路，抑制其活性，从而减轻心肌细胞凋亡。

心肌细胞；缺血缺氧；重组9型腺相关病毒；FrzA基因；Wnt信号通路；细胞凋亡

心肌细胞缺血缺氧是导致心肌细胞凋亡、造成心肌梗死的重要病理基础[1]。Wnt信号通路是一个调节机体生长发育、疾病、衰老及细胞分化凋亡的重要信号通路，在动物心脏发育过程中起到关键作用[2]。大量研究表明，Wnt信号通路在成人健康的心脏中是沉默的，心肌梗死后Wnt信号通路被持续激活，从而刺激细胞凋亡，加速心室重塑的进程[3～5]。可溶性Frizzled相关蛋白1(FrzA)是一种分泌型糖蛋白，它通过与Wnt信号通路的特异性受体卷曲蛋白受体竞争性结合Wnt蛋白，从而抑制Wnt信号通路的活性[6]。2015年10～12月，我们建立大鼠体外心肌细胞缺血缺氧模型，观察FrzA基因转导对心肌细胞Wnt信号通路过度表达的抑制作用及其心肌细胞凋亡的影响。

1　材料与方法

1.1材料1～3 d 新生SD乳鼠(由新疆医科大学第一附属医院实验动物中心提供)、DMEM培养基(Gibco，美国)、FBS(Gibco，美国)、双抗(青霉素链霉素溶液)(HyClone，美国)、谷氨酰胺(Sigma，美国)、D-Hanks(Sigma，美国)、胰蛋白酶(Sigma，美国)、Ⅱ型胶原酶(Worthington，美国)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU) (Sigma，美国)、恒温离心机(Thermo，美国)、二氧化碳培养箱(Thermo，美国)、垂直流超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司，中国)、倒置荧光显微镜(LEICA，德国)、9型腺相关病毒(rAAV9)-GFP及rAAV9-CMV-FrzA(构建包装纯化来自美国Virovek公司)、PCR引物(设计及合成来自上海生物工程有限公司)、PCR试剂盒(Fermentas，美国)、TRIzol抽提RNA试剂盒(Invitrogen，美国)。抗兔的β-catenin、c-Myc、Bcl-2、Bax、GADPH的多克隆抗体(CST，美国)、抗兔的Dvl-1的多克隆抗体(Abcam，美国)

1.2乳鼠心肌细胞原代培养及分组采用胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶依次消化法获取乳鼠心肌细胞，并用差速贴壁法和化学抑制法进行纯化，分离培养具体方法见文献[7]。取原代培养3 d的心肌细胞，随机分空白组、缺血缺氧组、缺血缺氧+rAAV9-CMV-eGFP组(空病毒组)、缺血缺氧+rAAV9-CMV-FrzA组 (FrzA组) 。

1.3FrzA基因转导将心肌细胞以每皿5×105个接种于直径60 mm培养皿，用含10%FBS的高糖培养基培养3 d后弃去培养基，无血清DMEM培养基轻洗细胞2次, rAAV9-CMV-eGFP和rAAV9-CMV-FrzA分别加入无血清的DMEM培养基中，使其覆盖细胞表面。37 ℃、5%CO2孵育2 h后补加DMEM及FBS，使FBS的浓度为10%，在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.4心肌细胞缺血缺氧模型建立在病毒转染第5天时建立心肌细胞缺血缺氧模型，用PBS洗涤细胞2～3次，加入模拟缺血液(无糖DMEM，并且不添加FBS)，将细胞置于三气培养箱中，通入95%N2、5%CO2的混合气体，30 min后停止通气并密封。培养持续12 h。

1.5心肌细胞FrzA mRNA表达检测采用RT-PCR法。以TRIzol法提取各组心肌细胞中的RNA后鉴定纯度，反转录过程严格参照试剂盒进行。PCR条件为:94 ℃变性2 min，根据不同引物选取不同退火温度，72 ℃延伸30 s，共35个循环后，再延伸5 min，琼脂糖凝胶电泳鉴定，以β-actin作为内参，检测心肌细胞FrzA mRNA表达。

1.6心肌细胞Wnt信号通路相关分子表达及凋亡蛋白检测采用Western blotting法。收集各组细胞，经裂解提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加样总蛋白量40 μg，以上样缓冲液等体积稀释。4 ℃冰浴下SDS-PAGE电泳，湿转到PVDF膜上，常规0.05%TBST洗膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，孵育相应一抗、二抗，然后加入显色液，放入化学发光仪曝光。用Image lab图像分析软件对Western blotting图片进行分析，以GADPH蛋白作为参照，检测心肌细胞Wnt信号通路相关分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc表达。检测心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，以Bax/Bcl-2值评价细胞凋亡情况。

2　结果

2.1各组心肌细胞FrzA mRNA表达空白组、缺血缺氧组、空病毒组、FrzA组的FrzA mRNA相对表达量分别为0.24±0.12、0.27±0.15、0.24±0.16、2.25±0.17。与空白组、缺血缺氧组、空病毒组比较，FrzA组心肌细胞FrzA mRNA表达明显增强(P均<0.05)。

2.2各组心肌细胞Wnt信号通路相关分子表达空白组、缺血缺氧组、空病毒组、FrzA组的β-catenin相对表达量分别为0.024±0.001 2、0.083±0.003 4、0.081±0.005 7、0.058±0.002 5，Dvl-1相对表达量分别为0.13±0.025、0.29±0.034、0.28±0.037、0.15±0.023，c-Myc相对表达量分别为0.022±0.002 3、0.071±0.003 6、0.067±0.002 5、0.045±0.003 5。缺血缺氧组、空病毒组及FrzA组Dvl-1、β-catenin、c-Myc在心肌中的表达均高于空白组(P均<0.05)。与缺血缺氧组、空病毒组相比，FrzA组Dvl-1、β-catenin、c-Myc的表达降低(P均<0.05)。

2.3各组心肌细胞凋亡情况空白组、缺血缺氧组、空病毒组、FrzA组的Bax/Bcl-2值分别为1.25±0.45、3.52±0.41、3.47±0.39、2.26±0.49。缺血缺氧组、空病毒组及FrzA组Bax/Bcl-2值均高于空白组(P均<0.05)。与缺血缺氧组、空病毒组相比，FrzA组Bax/Bcl-2值降低(P均<0.05)。

3　讨论

研究表明，Wnt信号通路正常情况下是沉默的，在各种病理状态下被重新激活。在体外研究发现，小鼠心肌组织在缺血缺氧状态下，Wnt信号通路被过度激活，并诱导了心肌细胞的凋亡[8]。本实验研究在细胞水平证实，与正常心肌细胞相比，在心肌细胞缺血缺氧模型中，Wnt信号通路的相关分子β-catenin、Dvl-1、c-Myc表达增强，说明心肌细胞在缺血缺氧的状态下Wnt信号通路被重新激活，心肌细胞凋亡增加。

近年来，干预Wnt信号通路从而防治心血管疾病已日益受到重视，研究人员从Wnt信号通路的不同阶段对其活性进行干预。抑制Wnt信号通路的活性，将减少心肌细胞凋亡，缩小心肌梗死面积，改善心功能[9]。然而在以前的研究中，大都是通过转基因小鼠或基因敲出小鼠的方法干预Wnt信号通路，这样会同时对所有组织和细胞造成影响，胚胎死亡率[10]和心梗后心脏破裂都会大大增加。研究证实，rAAV9对心肌有极强的靶向亲和力[11]，可长期稳定地表达外源基因，是目前心脏疾病基因治疗的最佳载体[12]。因此本实验中，我们利用rAAV9载体携带FrzA基因靶向干预心肌，避免了对其他组织和细胞的影响。

FrzA与Wnt信号通路中的frizzled受体有着相似的富含半胱氨酸区的分泌蛋白，因缺乏穿膜区而不能和质膜结合，但可与间质中循环的Wnt结合，从而阻止Wnt蛋白与质膜上的frizzled受体结合，对Wnt信号通路起负调控作用[13]。Duplàa等[14]报道，FrzA基因主要在主动脉内皮、心脏、脾脏、眼睛、血管等组织中表达，在胚胎期血管发生早期及血管形成过程中发挥重要作用。研究证实，FrzA 基因的过表达能抑制小鼠急性心肌梗死后Wnt通路的激活，显著减少心肌梗死面积，减少炎性细胞浸润，抑制心肌细胞凋亡，增加毛细血管密度，使心脏破裂发生率降低50%，最终减轻心室重塑、改善心功能[15]。本研究在细胞水平证实，FrzA基因转染可以有效抑制缺血缺氧时被激活的Wnt信号通路，使Wnt信号通路关键分子Dvl-1、β-catenin、c-Myc水平及凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax值降低，减少了缺血缺氧造成的心肌细胞凋亡，从而为基因治疗缺血性心脏病提供了新的思路。

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Effects of FrzA gene transduction on Wnt signaling pathway expression and apoptosis of cardiomyocytes in rats with ischemia-hypoxia in vitro

LIHuayin1,TAOJing,MAYitong,LIUFen,CHENBangdang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ObjectiveTo investigate the effects of recombinant adeno-associated virus type 9 (rAAV9) carrying FrzA gene transduction in inhibiting Wnt signaling pathway activity and on myocardial apoptosis of cardiomyocytes in rat models with ischemia-hypoxia.MethodsThe myocardial cells of SD rats were isolated and cultured. A recombinant AAV9 vector carrying FrzA gene was transfected into cardiomyocytes and then a hypoxia model was created. We divided them into four groups: control group, ischemia-hypoxia group, ischemia-hypoxia + empty virus (rAAV9-CMV-GFP) group (empty virus group) and ischemia-hypoxia + rAAV9-CMV-FrzA group (FrzA group). RT-PCR was used to detect the expression of target gene FrzA, and Western blotting was applied to detect the levels of Dvl-1, β-catenin and c-Myc as well as expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax. ResultsOn the fifth day after virus transfection, the FrzA target gene was highly expressed in cardiomyocytes (allP<0.05). The expression of Wnt signaling pathway molecules Dvl-1, β-catenin and c-Myc was significantly higher in the ischemia-hypoxia group, empty virus group and FrzA group, and the ratio of Bax/Bcl-2 was also higher than that of the control group (allP<0.05). The expression of Wnt signaling pathway molecules Dvl-1, β-catenin and c-Myc was significantly lower in FrzA group, and the ratio of Bax/Bcl-2 was also lower than that of the ischemia-hypoxia group and empty virus group (allP<0.05).Conclusion rAAV9 carrying FrzA gene can effectively intervene the Wnt signaling pathway and inhibit its activity and thus reduce the apoptosis of cardiomyocytes.

cardiomyocytes; ischemia-hypoxia; recombinant adeno-associated virus type 9; FrzA gene; Wnt signaling pathway; apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81470468)；新疆维吾尔自治区研究生创新基金资助项目(XJGRI2015064)。

李华垠(1990-)，男，住院医师，主要从事心血管内科疾病的诊治。E-mail：332075368@qq.com

简介：马依彤(1961-)，男，主任医师，教授，主要从事心血管疾病基础研究及临床治疗。其心血管病相关研究获新疆维吾尔自治区科技进步奖、乌鲁木齐市科技进步奖、新疆医学科技进步奖多项。E-mail：myt-xj@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.003

R542.2

A

1002-266X(2016)33-0008-03

2016-01-14)