TNF-α抑制剂通过激活Notch1信号通路治疗创伤后心肌再灌注损伤的实验研究

王卫芳，柳潇，计晓玲，杨波

· 论著 ·

TNF-α抑制剂通过激活Notch1信号通路治疗创伤后心肌再灌注损伤的实验研究

王卫芳1，柳潇1，计晓玲1，杨波1

目的探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）抑制剂（依那西普）通过跨膜蛋白受体Notch1信号通路对小鼠创伤性心肌损伤的保护作用。方法选取c57系清洁级雄性小鼠36只（10～12周龄），采用随机数字表法分为假手术组（腹腔注射5 ml/kg生理盐水）、对照组（腹腔注射5 ml/kg生理盐水）、依那西普组（建立创伤后心肌缺血再灌注损伤模型，依那西普8 mg/kg）各12只，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组小鼠再灌注30 min后的血浆TNF-α、3 h后的血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）浓度，测定各组再灌注24 h后的左室射血分数（LVEF）、采用TUNEL染色法检测各组心肌细胞凋亡率、采用TTC双染色检测各组心肌梗死面积比值，采用免疫印迹法（Western-blot）检测再灌注6 h后心肌跨膜蛋白受体Notch1胞内活性片段（Notch1-ICD）、细胞凋亡相关蛋白3（caspase-3）的表达。结果对照组、依那西普组大鼠的血浆TNF-α、血清cTnI水平、心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值均显著高于假手术组（P＜0.05）；依那西普组血浆TNF-α、血清cTnI水平、心肌caspase-3蛋白表达水平、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值显著低于对照组（P＜0.05），Notch1-ICD蛋白表达水平、LVEF值显著的高于对照组（P＜0.05）。结论TNF-α抑制剂对创伤后心肌缺血再灌注损伤心肌具有保护作用，其作用机制与激活Notch1信号通路以调节caspase-3蛋白表达水平有关。

肿瘤坏死因子-α抑制剂；跨膜蛋白受体Notch1信号通路；创伤；再灌注

创伤是造成人类死亡的重要原因之一，其能明显增加患者心肌梗死和继发性心功能不全的发生率，甚至造成死亡[1]。目前临床上多采用心肌缺血再灌注的方式治疗心脏性疾病，但容易导致心肌损伤，严重影响患者的生活质量[2]。有研究表明[3]，Notch信号通路参与了多种氧化应激和炎症病理过程，与心肌梗死等心脏疾病的发生和发展有密切的关系。肿瘤坏死因子（TNF-α）抑制剂能够有效拮抗TNF-α，并能增加炎性肠黏膜上皮细胞中Notchl的表达，从而提高了上皮黏膜局部血流灌注，进一步减轻创伤后再灌注的损伤[4]。为了进一步探讨TNF-α抑制剂通过跨膜蛋白受体Notch1 信号通路对创伤性心肌损伤的保护作用，本研究将雄性小鼠成功建立创伤后心肌缺血再灌注损伤模型后随机分为假手术组、对照组、依那西普组，探讨了TNF-α抑制剂的保护性作用，报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物及分组选取c57系清洁级的雄性小鼠36只，10～12周龄，喂养于光照12 h，温度23～25℃，相对湿度45%～60%，购买自上海加科生物科技有限公司。采用NobleCollip鼓建立创伤模型[3]，速率为40转/min，创伤5 min（共200转），并采用随机数字表法分为假手术组、对照组、依那西普组，每组小鼠12只。创伤模型建立7 d后再建立缺血再灌注损伤模型，具体方法如下：将小鼠麻醉后经左胸前第4、5肋间暴露心脏，将冠状动脉左前降支结扎30 min，松开扎线后实现再灌注。所有小鼠在造型成功后放回笼内，呼吸空气3～5 min后观察小鼠能否恢复正常神智并活动自如。假手术组小鼠只暴露心脏后细线穿过冠状动脉但不结扎，而对照组、依那西普组小鼠结扎前40 min分别腹腔注射5 ml/kg生理盐水、依那西普8 mg/kg，灌注后6～8 h（经过开胸、结扎、注射等过程）形成稳定的模型。模型成功制备标准：II导联ST段弓背向上抬高，心脏表面区域变暗，再灌注后心电图ST段下降1/3以上。

1.2 观察指标观察灌注后TNF-α、心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平的表达、Notch1-ICD、caspase-3蛋白的表达及左室射血分数（LVEF）、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值对照组。采用免疫印迹法（Western-blot）检测再灌注6 h后心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白的表达，具体方法如下：称取已进行蛋白定量的各组织样品，电泳分离并转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭液，4℃条件下封闭1 h。随后加入Caspase-3蛋白抗体和抗Notchl胞内片段抗体孵育过夜后检测并分析结果。Caspase-3蛋白抗体和抗Notchl胞内片段抗体均购自英国Abcam公司。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测小鼠灌注30min后的血浆TNF-α水平和灌注3 h后的血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平，酶标仪为德国拜发仪器公司生产，检测试剂盒均购自北京陆桥科技公司，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。灌注24 h后利用2%异氟烷将小鼠进行麻醉，然后利用小动物超声系统测定小鼠的LVEF。将缺血心肌再灌注3 h后的心脏以4%的福尔马林溶液内固定24 h，作4～5 μm的石蜡切片，随后采用TUNEL染色法测定心肌细胞凋亡水平（凋亡细胞呈现出核深质钱的暗绿色，心肌细胞凋亡率=凋亡细胞数目/总细胞数目×100%）。TUNEL染色试剂盒购自瑞典Roche 公司，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。采用双染色检测各组心肌梗死面积比值，具体方法如下：将小鼠再次阻断冠状动脉并从冠状动脉处打入1.5%伊文氏蓝，染色30 s后将心脏取出并做冷冻切片。将切好的心脏薄片用PBS清洗干净后在2%TTC溶液中37℃避光静置30 min，随后放在载玻片上置入装有PBS的培养皿，拍照后利用软件分析图像，心肌梗死面积比值=梗死心肌面积/缺血再灌注心肌总面积×100%（心肌细胞梗死面积的计算采用南京凯基生物科技公司生存HSO系列超声诊断仪器进行诊断）。LVEF的表达测量采用南京凯基生物科技公司生存HSO系列超声诊断仪器进行诊断，频率设置为3.5～5.5 MHz，由两名富有经验的超声诊断医师进行诊断。

1.3 统计学方法采用SAS 9.1统计软件进行统计分析。正态分布的计量指标采用平均数±标准差（s）进行描述，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两LSD-t检验；以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血浆TNF-α、血清cTnI水平比较对照组、依那西普组大鼠的血浆TNF-α、血清cTnI水平显著高于假手术组（P＜0.05）；依那西普组血浆TNF-α、血清cTnI水平显著低于对照组（P＜0.05）（表1）。

2.2 各组大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达比较对照组、依那西普组大鼠的心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达水平显著的高于假手术组（P＜0.05）；依那西普组心肌caspase-3蛋白表达水平显著低于对照组（P＜0.05），Notch1-ICD蛋白表达水平显著的高于对照组（P＜0.05）（表2）。

2.3 各组大鼠LVEF、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值比较对照组、依那西普组大鼠的心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值显著高于假手术组（P＜0.05），LVEF值显著低于假手术组（P＜0.05）；依那西普组心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值水平显著低于对照组（P＜0.05），LVEF值显著高于对照组（P＜0.05）（表3、图1）。

表1 各组大鼠血浆TNF-α血清cTnI水平比较（s）

表1 各组大鼠血浆TNF-α血清cTnI水平比较（s）

注：TNF-α：肿瘤坏死因子-α；cTnI：心肌肌钙蛋白I；与假手术组比较，aP＜0.05，与对照组比较，bP＜0.05

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表2 各组大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达比较（s）

表2 各组大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达比较（s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与对照组比较，bP＜0.05；Notch1-ICD：心肌跨膜蛋白受体Notch1胞内活性片段；caspase-3：细胞凋亡相关蛋白3

组别 例数 Notch1-ICD/β-actin caspase-3/β-actin假手术组 12 0.27±0.09 1.05±0.08对照组 12 0.98±0.14a2.49±0.27a依那西普组 12 1.58±0.20ab1.42±0.22abF值 — 55.295 13.047 P值 — ＜0.001 0.007

3 讨论

TNF-a是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是迄今为止发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一[5-7]；其主要由激活的巨噬细胞产生，并有效能抑制成骨细胞和刺激破骨细胞[8]，对抑制心肌收缩、诱导细胞凋亡及降低血压等作用明显[9,10]。TNF-α抑制剂可竞争性结合TNF-α受体，从而降低心肌梗死后白细胞浸润和细胞外基质破坏[11]。依那西普作为一种新型的TNF-α抑制剂可明显阻断TNF-α与膜表面受体结合，进一步降低TNF-α的活性，从而抑制由TNF-α介导的多类异常免疫反应和炎症反应[12]。依那西普能最大程度的保护创伤性心肌损伤小鼠的心脏功能，进一步减少其心肌梗死面积，并抑制心肌细胞的凋亡[13]。依那西普等TNF-α抑制剂保护创伤性心肌损伤小鼠心脏功能与心肌Notchl信号通路的变化有密切关系[14]。Notchl是Notch蛋白的受体，其能释放Notchl胞内段转移到细胞核内并导致细胞内核转录基因的表达，进而影响心血管系统疾病的发生和发展。激活Notchl可促进下游信号分子的表达进而抑制转移起始因子的表达作用，并能减轻心肌损伤引起的氧化应激与硝化应激损伤，进而保护缺血心肌细胞[13]。而TNF-α抑制剂能明显激活黏膜上皮细胞中Notchl胞内活性片段的表达，进而减轻创伤性心肌损伤[13]。

图1 各组大鼠心肌凋亡细胞TUNEL染色（100 μm）：绿色为凋亡细胞，蓝色为所有细胞。

为了进一步探讨TNF-α抑制剂通过跨膜蛋白受体Notch1信号通路对创伤性心肌损伤的保护作用，本研究将雄性小鼠成功建立创伤后心肌缺血再灌注损伤模型后随机分为假手术组、对照组、依那西普组，并对各组小鼠的血浆TNF-α、cTnI、LVEF、心肌细胞凋亡率和心肌梗死面积比值进行了分析比较。研究结果表明，对照组大鼠的血浆TNF-α和cTnI水平显著高于假手术组，而依那西普组则显著低于对照组；说明TNF-α在创伤性心肌损伤的发生和发展过程中起着重要的作用，而依那西普等TNF-α抑制剂能明显降低TNF-α的水平，进而降低心肌损伤的程度。依那西普组心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值水平显著低于对照组，心室射血分数值显著高于对照组（P＜0.05），说明TNF-α抑制剂能竞争TNF-α受体从而降低心肌细胞的凋亡率，并进一步抑制再灌注后心肌梗死面积的扩大。TNF-α抑制剂可以通过拮抗单核细胞、巨噬细胞等对于心肌细胞膜的损伤，进而减轻心功能的恶化，缓解病情的恶性进展。但需要注意的是，Bomb R等[13]研究者的研究中并未发现TNF-α抑制剂治疗后的心肌细胞凋亡率的改善，这与本研究的结论存在一定的差别，考虑到检测方式的不统一、心肌细胞凋亡率的计算方法的不一致等，均可能导致了最终结论的差别。而进一步观察各组大鼠心肌Notch1-ICD、caspase-3蛋白表达水平发现，依那西普组caspase-3蛋白表达水平显著的低于对照组，Notch1-ICD蛋白表达水平显著的显著的高于对照组，提示TNF-α抑制剂能通过调节Notchl信号通路，进而激活Notchl受体释放大量Notch1-ICD，进一步调控Hes1基因的表达，从而降低心肌损伤，更有效地保护了心肌细胞。

表3 各组大鼠LVEF%、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值比较（s）

表3 各组大鼠LVEF%、心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积比值比较（s）

注：LVEF：左室射血分数；与假手术组比较，aP＜0.05，与对照组比较，bP＜0.05；LVEF：左室射血分数

组别 例数 LVEF（%） 心肌细胞凋亡率（%） 心肌梗死面积比值（%）假手术组 12 53.61±4.29 1.62±0.39 0对照组 12 27.50±3.95a20.50±3.14a44.61±4.18a依那西普组 12 45.08±5.17ab5.51±1.63ab30.52±4.25abF值 — 18.993 68.024 177.498 P值 — ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

综上所述，TNF-α抑制剂能有效减少创伤后心肌缺血再灌注造成的心肌，并对损伤心肌具有良好的保护作用，其作用机制可能与激活Notch1信号通路有关。但本研究限于研究样本不足，对TNF-α抑制剂调控Notchl信号通路的机制及TNF-α与心肌缺血再灌注损伤远期病死率的关系仍需作进一步的深入研究。

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本文编辑：阮燕萍本文编辑：田洪榛，田国祥

Study of TNF-α inhibitor on myocardial reperfusion injury by activating Notch1 signaling pathway

WANG Wei-fang*, LIU Xiao, JI Xiao-ling, YANG Bo.*Department of Cardiology, Chifeng Hospital, Inner Mongolia, Chifeng 024000, China.
Correspondence author：WANG Wei-fang, E-mail: Yangvitor@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of tumor necrosis factor-α (TNF-α) inhibitor (etanercept) through the transmembrane receptor signaling pathway on traumatic myocardial injury in mice.Methods36 male mice(10-12 weeks of age) were randomly divided into sham operation group(intraperitoneal injection of 5 ml/kg normal saline), control group (post - traumatic myocardial ischemia - reperfusion injury were prepared, intraperitoneal injection of 5 ml/kg normal saline) and etanercept group (post - traumatic myocardial ischemia -reperfusion injury were prepared, intraperitoneal injection Etanercept 8 mg/kg). TNF-αlevel at 30 minutes after reperfusion and serum cardiac troponin I (cTnI) concentration at 3 hours after reperfusion were measured by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). The left ventricular ejection fraction (LVEF) was measured 24 hours after reperfusion. TUNEL staining was used to measure the apoptotic rate of cardiomyocytes. The area of myocardial infarction was determined by TTC double staining. The expression levels of intracellular domain of Notch1 (Notch1-ICD) and caspase-3 were measured by western blot.ResultsThe levels of serum TNF-α and serum cTnI, and caspase-3, apoptotic rate of cardiomyocytes and the area of myocardial infarction in the control group and etanercept group were significantly higher than those in the sham operation group (P＜0.05). The levels of serum TNF-α and serum cTnI, the expression level of caspase-3, apoptotic rate of cardiomyocytes and the area of myocardial infarction in the etanercept group were significantly lower than those in the control group (P＜0.05). The value of LVEF and the expression level of Notch1-ICD were significantly higher than those in the control group (P＜0.05).ConclusionTNF-αinhibitors have protective effects on myocardium after myocardial ischemia-reperfusion injury, and its mechanism is related to activation of Notch1 signaling pathway to regulate the expression of caspase-3 protein.

Tumor necrosis factor-α inhibitor; Notch1 signaling pathway; Trauma; Reperfusion

R542.2

A

1674-4055(2016)12-1504-04

1024000 赤峰,内蒙古赤峰市医院心血管内科

王卫芳,E-mail:Yangvitor@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.26