miRNA-126在颈动脉粥样硬化患者中的表达及意义

骆　瑜　熊　玮　梁　旭

(暨南大学第二临床医学院　深圳市人民医院老年病科，广东　深圳　518020)



miRNA-126在颈动脉粥样硬化患者中的表达及意义

骆瑜熊玮1梁旭

(暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院老年病科，广东深圳518020)

〔摘要〕目的研究颈动脉粥样硬化患者中血液中小分子RNA-126(miR-126)与斑块稳定性之间的关系。方法选择可能存在颈动脉硬化的患者，根据颈动脉超声检测结果分为正常组、稳定斑块组和不稳定斑块组，常规检测血压、体重指数(BMI)、肝肾功能、血糖、血脂、尿酸、超敏C反应蛋白(hs-CRP)，采用real time PCR检测外周血中的miRNA-126的表达水平。结果三组患者的年龄、BMI、血压、血糖、血脂、尿酸、肝肾功能均无明显差异(P>0.05)；不稳定斑块组患者的hs-CRP明显升高(P<0.05)；与正常组相比，稳定斑块组患者血液中的miR-126水平上升(P<0.05)，不稳定斑块组患者的miR-126水平更加显著(P<0.01)。miR-126与hs-CRP具有相关性。结论miR-126可能参与了颈动脉粥样硬化发展的病理过程，可能是易损斑块的生物学标志之一。

〔关键词〕小分子RNA-126；颈动脉；不稳定斑块

1暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院心内科

第一作者：骆瑜(1979-)，女，副主任医师，主要从事老年病学研究。

动脉粥样硬化(AS)是临床上常见的心血管疾病，也是危害人群健康的主要心血管疾病。由于AS导致的脑卒中和冠心病已成为导致我国居民死亡的首要原因〔1〕。miRNA (microRNA，miR)是一类长度21～29个核苷酸的小分子非编码RNA，它们能够识别特定的目标mRNA，在转录后水平负调控基因表达，编码超过30%的基因，与人类的生命活动和疾病的发生关系十分密切〔2〕。miR-126是内皮细胞特异性的miRNA，它的缺乏会损害胚胎血管的完整性，使新生血管减少，导致血管的形态和功能出现改变〔3〕。本文通过研究颈动脉粥样硬化患者血液中miR-126的水平变化，探讨miR-126与AS及斑块稳定性之间的关系。

1材料与方法

1.1研究对象2011年7月至2013年9月在我院就诊的门诊和住院患者。所有病例均为无血缘关系的华南地区汉族人群，经相关检查排除急慢性感染、手术、创伤、肝肾疾病、恶性肿瘤、类风湿性疾病、继发性高血压、心力衰竭、心瓣膜病以及存在酗酒、服用避孕药的患者。

1.2研究方法

1.2.1一般项目检测所有患者常规检查血压，连续测量3次，取平均值作为该患者的血压。测量身高、体重，计算体重指数(BMI)。所有受试者空腹8 h以上于清晨取卧位肘静脉血4 ml，-80℃保存待测。所有患者常规测定谷丙转氨酶(GPT)、血肌酐、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、空腹血糖(FPG)、血尿酸(UA)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)。

1.2.2颈动脉彩色多普勒超声检查采用飞利浦公司IE33型彩色多普勒超声显像仪，由专人进行检查，探头频率7.5~10.0 MHz，常规检查颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。测量血管内径、颈动脉内中膜厚度(IMT)，观察斑块的部位、大小、形态、数量、回声特点、血流信号、有无充盈缺损等。将IMT>1.0 mm定义为颈动脉内膜增厚；IMT>1.3 mm并明显突出内膜为颈动脉斑块形成。硬斑为斑块呈强回声；软斑为斑块呈中等或弱回声，形态规则或不规则，内膜向腔内凸起，内部结构均匀或不均匀；混合斑形态介于硬斑及软班之间。硬斑为稳定性斑块，软斑和混合斑为不稳定性斑块。所有患者均连续测量每侧颈动脉3次，取平均值计算IMT。

1.2.3real time PCR检测miR-126按照RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen公司)说明书提取RNA，紫外分光光度仪(260/280 nm)检测RNA浓度(1.8~2.0者采用)，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定总RNA的纯度。cDNA合成：按照miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR试剂盒(EXIQON公司)说明书操作。取模板RNA 14 μl，Enzyme mix 2 μl，5×RT缓冲液4 μl，总体积20 μl，于PCR仪42℃1 h，95℃5 min进行逆转录反应。合成的cDNA置于-20℃保存备用。荧光定量PCR：反应体系20 μl，包括SYBR Green mix 10 μl，PCR primer mix 2 μl，稀释的cDNA模板8 μl。反应条件：95℃10 min，95 ℃10 s，60℃1 min，40次循环。每标本均做3个复孔。以U6作为内参，放入7900荧光定量PCR仪中检测，根据公式miR-126相对表达量=2-(ΔCt sample-ΔCt control)计算。miR-126上下游引物由EXIQON公司合成。

2结果

2.1一般情况在83例患者中，男54例，女29例，年龄30~87〔平均(53.3±8.4)〕岁，其中正常组患者21例，稳定斑块组36例，不稳定斑块组患者26例。3组患者的平均年龄、血压、BMI、GPT、血肌酐、血脂、血糖、血UA均无明显差异(P>0.05)。与正常组相比，稳定斑块组患者的血hs-CRP水平上升，但差异不显著(P>0.05)，不稳定斑块组患者的hs-CRP则显著升高(P<0.05)。见表1。

表1　3组患者的临床资料

与正常组比较:1)P<0.05

2.2miR-126表达与正常组患者(1.02±0.12)相比，稳定斑块组(1.54±0.25)及不稳定斑块组(2.68±0.44)患者血液miR-126水平均上升(P<0.05，P<0.01)；不稳定斑块组患者的miR-126水平与hs-CRP水平之间呈正相关(r=0.722，P<0.05)。

3讨论

小分子RNA作为一个广泛分布的重要的基因调节子，在机体的正常生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡等生理和病理过程均发挥着重要作用。近年来，对miRNA表达调控机制及其调控相关疾病如恶性肿瘤、病毒感染、炎症和免疫性疾病、内分泌及代谢性疾病以及作为基因靶向药物的研究表明miRNA不仅参与了疾病的发生发展，同时也可以作为疾病的生物学诊断标志用于疾病的诊断，作为基因药物可用于疾病的治疗〔3~6〕。

miRNA的表达具有组织特异性和时序性。miR-126在呼吸系统、造血系统、生殖系统、消化系统和胚胎组织均有表达，但在心血管系统中的特异性最高〔7〕。研究发现，敲除斑马鱼的miR-126基因后，胚胎血管的发育受损害，血管的完整性被破坏从而导致出血〔3〕。该作用的发生与血管内皮生长因子信号通路的抑制或SPRED-1的表达增加有关〔3〕。敲除小鼠的miR-126基因后，血管内皮细胞的增殖和迁移能力下降，血管完整性破坏导致出血和死亡，而缺乏miR-126基因的成年小鼠因为心脏血管的缺陷而发生心肌梗死〔3〕。血流刺激是促进血管形成的因素之一。在血流机械力的作用下，锌指蛋白诱导转录因子klf2a表达增加，促进内源性的miR-126生成，miR-126激活血管内皮生长因子信号通路，促进血管的生成和发育〔8〕。在心肌梗死的动物模型研究发现，局部注射miR-126可以促进缺血心肌的血管再生，改善心肌的血液灌注〔9〕。血管细胞间黏附分子-1被发现是miR-126的靶基因之一，miR-126通过抑制血管细胞间黏附分子-1的表达，阻断血液中的白细胞和内皮细胞的黏附，抑制的发生〔10〕。在冠心病导致的慢性心功能衰竭时循环miR-126水平显著下降，其水平与脑钠肽负相关，随着心功能改善，miR-126水平上升，表明miR-126亦可作为心力衰竭的循环标志物〔11〕。

斑块破裂、血管痉挛和随之发生的血小板黏附、聚集及继发性血栓形成是急性冠状动脉综合征和脑卒中发生的主要病理生理机制。本研究结果提示miR-126可能参与了颈动脉粥样硬化的病理发展过程。且随着miR-126水平的升高，不稳定斑块患者的hsCRP水平也升高，两者呈正相关，表明miR-126与颈动脉粥样硬化的炎症反应具有相关性。

本研究虽然发现颈动脉粥样硬化患者的循环miR-126升高，促进中国患者颈动脉粥样硬化的发生发展，但也有研究发现冠心病患者的血液miR-126水平下降，miR-126可能对冠心病进行负调控〔12〕。如何解释这种研究结论的差异并阐明miR-126参与AS病理过程的分子机制需要进一步的研究。

4参考文献

1卫生部心血管病防治研究中心.中国心血管病报告(2012)〔M〕.北京：中国大百科全书出版社，2013:1-9.

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4Creemers EE，Tijsen AJ，Pinto YM.Circulating microRNAs：novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease〔J〕? Circ Res，2012；110(3)：483-95.

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7Wei Y，Nazari-Jahantigh M，Neth P，etal.MicroRNA-126，-145，and-155：a therapeutic trial in atherosclerosis〔J〕?Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013；33(3)：449-54.

8Niscoli S，Stansley C，Walker P，etal.MicroRNA-mediated integration of haemodynamics and vegf signaling during angiogenesis〔J〕.Nature，2010；464(7292)：1196-200.

9Chen JJ，Zhou SH.Mesenchymal stem cells overexpressing MiR-126 enhance ischemic angiogenesis via the AKT/ERK-related pathway〔J〕.Cardiol J,2011；18(6)：675-81.

10Harris TA，Yamakuchi M，Ferlito M，etal.MicroRNA-126 regulates endothelial expression of vascular cell adhesion molecule 1〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2008；105(5)：1516-21.

11Fukushima Y，Nakanishi M，Nonogi H，etal.Assessment of plasma miRNAs in congestive heart failure〔J〕.Circ J，2011；75(2)：336-40.

12郑志伟，劳海燕，余细勇，等.冠心病患者血浆循环miR-126的表达及其对血管内皮细胞的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2011；27(12)：2313-7.

〔2014-11-09修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0577-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.027