阿尔茨海默病小鼠与野生型小鼠海马中miRNA表达差异

杨　群　苏　波　郑　郧　任伯绪　刘　洋

(长江大学医学院机能学部，湖北　荆州　434023)



阿尔茨海默病小鼠与野生型小鼠海马中miRNA表达差异

杨群1苏波2郑郧任伯绪1刘洋

(长江大学医学院机能学部，湖北荆州434023)

〔摘要〕目的分析D-半乳糖联合AlCl3诱导阿尔茨海默病(AD)与野生型小鼠海马microRNAs(miRNAs)表达差异。方法昆明种小鼠，随机分成AD模型组和野生型对照组，AD模型组每日腹腔注射D-半乳糖90 mg/kg和AlCl340 mg/kg溶液，野生型对照组腹腔注射等量的生理盐水，1次/d，连续90 d。物体识别实验测试各组小鼠识别、记忆能力。miRNA芯片检测各组小鼠海马miRNAs的表达，并进行后续的生物信息学分析。结果在物体识别实验中，AD模型组小鼠探索新物体所用的时间较野生型对照组减少(P<0.01)，分辨指数(8.97±1.33)较野生型对照组(34.42±3.74)减低(P<0.001)。在3批次AD模型组和野生型对照组间均有显著变化的17个miRNAs(≥2.0倍上调或下调)的预测靶基因重点分布在AD相关信号通路、神经营养因子信号通路、长时程增强效应相关通路，并处于这些信号通路的关键位置。结论17个差异表达的miRNAs 可能通过调节相关信号通路关键细胞因子的表达，参与AD的进程。

〔关键词〕阿尔茨海默病；microRNA；生物信息学分析

1长江大学医学院医学影像学系

2长江大学医学院形态学部

第一作者：杨群(1989-)，女，硕士，主要从事神经退行性疾病分子机制研究。

microRNA(miRNA)是一类长度约为19~25个核苷酸的小分子RNA。成熟的miRNA以不完全匹配方式结合到其互补的mRNA靶位(常常位于mRNA 3′-UTR)抑制翻译和影响mRNAs的稳定性〔1〕。最近研究发现，miRNA与阿尔茨海默病(AD)的发生和发展有着密切的联系〔2〕。miRNA可直接或间接调节β淀粉样蛋白(Aβ)代谢、磷酸化、胆固醇脂质代谢、轴突可塑性、细胞凋亡、细胞周期、神经炎症、氧化应激等与AD病理发生相关的关键基因表达〔3,4〕，提示miRNA 在调控AD发生发展中可能起到非常关键的作用。本研究采用D-半乳糖联合AlCl3诱导AD模型，对AD小鼠和野生型昆明小鼠海马中miRNA 的表达情况进行miRNA芯片检测，对miRNAs的表达结果进行比较分析，从而找到在小鼠海马的衰老退行中发挥重要调控作用的miRNAs。

1材料与方法

1.1动物清洁级雄性昆明种小鼠，体重20~25 g，购于湖北省实验动物研究中心，动物许可证号：SCXK(鄂)2008-0005。

1.2药品与试剂AlCl3(天津福晨化学试剂厂)；D-半乳糖(武汉科瑞生物)。

1.3实验分组及造模选用清洁级健康雄性昆明种小鼠，体重20~25 g，安静环境饲养，自由取食饮水，通风良好，室温22℃~25℃，适应性喂养1 w后随机分为两组，每组15只。AD模型组采用Luo等〔5〕的造模方法每日腹腔注射D-半乳糖90 mg/kg(生理盐水配制)和AlCl340 mg/kg(生理盐水配制)溶液，连续90 d；野生型对照组腹腔注射等量的生理盐水。

1.4物体识别实验造模90 d后，参考Stover等〔6〕方法进行物体识别实验。本实验装置采用40 cm×40 cm×25 cm乳白色泡沫方盒自制而成，方盒底部铺少许木屑，本实验用于辨识的物体为A、B、C，其中物体A与B相同，物体C不同于A与B，测试环境为隔音、避光的场所，在方盒上方用15 W白光灯照射。

实验分为适应期、熟悉期及测试期3个阶段。适应期将小鼠放入没有任何物体的实验方盒中，让其自由活动10 min以便适应测试环境，减少应激；熟悉期将A、B物体放在实验箱一侧壁的左右两端，小鼠背朝两个物体放入实验箱中，小鼠鼻尖距离两个物体的距离大致相等，放入后立即开启录像设备，记录5 min内小鼠与物体接触情况，包括鼻子和嘴巴触及物体的次数和距离物体2 cm以内探究的时间(前爪搭在物体上，鼻子嗅物体、舔物体均属探究物体)，结束后将小鼠放回饲养笼中，24 h后进行测试期实验。测试期将B物体更换为C物体，仍将小鼠背向物体放入记录小鼠对A、C两个物体的探究时间F、N，一般以辨别指数(DI)评价小鼠的物体识别能力，计算公式：DI=(N-F)/(N + F)×100% 。其中N为小鼠在测试期探索新物体的时间，F为小鼠在测试期探索旧物体的时间。

1.5miRNA芯片检测各组小鼠取海马，单侧海马加200 μl TRIzol(Invitrogen)，匀浆。全部操作在冰上完成，然后送样。miRNAs芯片检测选用丹麦Exiqon公司产品(V.16.0)，AD模型组和野生型对照组各进行三批次共6个样品的检测。具体检测由上海康成生物工程有限公司完成。实验方法：(1)用TRIzol(Invitrogen)和miRNeasy mini kit(Qiagen)依据所附产品说明提取总RNA，利用NanoDrop 1000对所提取RNA进行定量；(2)用miRCURYTM Hy3TM/Hy5TM Power labeling kit对6组所提取的样品进行标记，在miRCURYTM LNA Array(v.16.0)上杂交；(3)洗脱后，用Axon GenePix 4000B微阵列扫描仪对芯片进行扫描；(4)然后，将扫描图像输入GenePix Pro 6.0软件(Axon)进行比对、提取数据；(5)对各复孔miRNAs表达数据用中位数标准化方法进行统计学处理；(6)对重点分析的 miRNAs作出聚类图，显示这些 miRNAs 在6组不同样品中的表达谱。

1.6生物信息学分析相关软件及数据库

1.6.1miRNA 靶点预测数据库Mirbase(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/);Miranda(http://www.microrna.org/microrna/home.do);Mirdb(http://mirdb.org/miRDB/)。

1.6.2靶点基因的Gene Ontology(GO)和Pathway 分析数据库DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp);KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)。

1.7统计学分析采用SPSS13.0软件行t检验。

2结果

2.1D-半乳糖联合AlCl3对昆明种小鼠物体识别能力的影响D-半乳糖联合AlCl3所致AD模型组小鼠探索新物体所用的时间较野生型对照组减少(P<0.01)(图1)；AD模型组小鼠分辨指数(8.97±1.33)较野生型对照组(34.42±3.74)减低(P<0.001)。

图1　两组探索时间比较

2.2miRNA 芯片结果的比较分析 通过3批次共6个小鼠海马样品的miRNA芯片表达谱，对AD模型组和野生型对照组进行比较，2倍及以上上调和下调的miRNAs取3组样品比较的交集，共得到17个差异表达的miRNAs(≥2.0倍)(表1)，在AD模型组中，8个miRNAs明显上调，9个明显下调。将miRNAs输入靶点预测数据库(Mirbase、Miranda 和 Mirdb)，每个入选的mRNA序列上存在2个或以上的miRNAs结合位点，共得到 127个mRNA序列，然后将这些mRNA序列基因ID输入DAVID(Database for annotation,visualization,and integrated discovery)数据库，依靠DAVID 自带的GO分析系统依据这些基因的生物学功能的不同进行分组，随后进行 DAVID功能聚类分析。与中枢神经系统生理功能相关联的富集得分靠前的基因功能组被选出(表2)，对其做进一步深入分析。

表1　AD模型组和野生型对照组比较有显著变化的

M：AD模型组，W：野生型对照组

表2　127个预测靶基因的GO功能富集分析(TOP 9)

2.2.1突触的功能对差异表达的miRNAs靶基因进行功能注释聚类分析发现，突触相关功能的得分非常高。DAVID二维分析结果显示，有16个基因与GO分类条目中的突触传递、神经冲动传递的调控、行为功能、认知功能、学习记忆功能和突触的可塑性等密切相关。见表3。

2.2.2细胞凋亡细胞凋亡相关是另一个在功能注释聚类分析中的得分较高的功能聚类。共有 20个基因与GO条目中的细胞凋亡，细胞凋亡的正向与负向调节，抗凋亡和细胞程序性死亡的调节相关联。见表3。

2.2.3对分泌物的调节对分泌物的调节也是一个重要的功能聚类，一共有22个基因与GO条目中的分泌物的调节，转运的调节和细胞的定位的调节相联系。见表3。

2.2.4对激素刺激的反应同样，对细胞刺激的反应也是一个重要的功能聚类。离子型谷氨酸受体、Ras 基因等27个基因与GO条目中的对无机物的反应，对激素刺激的反应和胰岛素刺激的反应相关。见表3。

表3　预测靶基因在KEGG信号通路注释分析

2.3KEGG 通路分析对上述DAVID注释聚类分析中一些重要的GO条目进行了后续的KEGG(KEGG)通路分析，其中有与AD的发生、发展密切相关的AD相关信号通路；在脑组织广泛存在的，并在中枢神经系统各种神经细胞的生长、发育、维持及中发挥重要生理作用的神经营养因子信号通路；在大脑海马、皮层、边缘系统、小脑、中脑、丘脑等脑区广泛存在，和突触的可塑性，学习、记忆过程密切相关的长时程增强(LTP)相关信号通路。用红色标注这些参与各信号通路组成的miRNAs预测靶基因。如果进一步深入研究证实，选出的这些在比较中差异表达的 miRNAs 能通过与预测靶基因的mRNA 3′-UTR序列结合抑制目标基因的表达，表明这些 miRNAs 通过抑制重要细胞因子的表达调节上述重要的信号通路，进而对AD的发生、发展以及海马组织的生长、发育、维持和老化进程及学习记忆功能产生影响。见表4。

表4　差异表达miRNAs 预测靶基因的KEGG ID、描述和所在信号通路

3讨论

利用D-半乳糖联合AlCl3制备AD小鼠模型，表现为学习记忆减退、皮质和海马区Aβ蛋白水平增高、Aβ代谢相关分子表达受影响，可形成神经元纤维缠结(NFT)、老年斑(SP)等〔5〕。这些实验结果表明，D-半乳糖联合AlCl3诱导AD小鼠是一种稳定的、为国内外科研工作者所接受的AD动物模型。物体识别实验是一种利用啮齿类动物天生喜欢接近和探索新奇物体的本能来检测动物识别记忆的精细、敏感的行为学方法〔7〕。物体识别实验结果表明，本研究采用D-半乳糖联合AlCl3成功复制了小鼠模型。海马在物体识别记忆形成过程中起着重要作用〔8〕。最新研究表明，D-半乳糖联合AlCl3可造成小鼠海马区CREB1、超氧化物歧化酶(SOD)等的活性下降，导致物体识别能力等AD症状的产生〔9,10〕。

本文通过分析发现，3组样品中表达差异均大于2.0倍的miRNAs的靶基因重点分布在AD相关信号通路、神经营养因子信号通路、长时程增强效应相关通路，并处于这些信号通路的关键位置。

AD是一种进行性的神经退行性疾病，是痴呆的一种最普通形式，这种进行性疾病以Aβ累积形成为特征。这些多肽来源于Aβ淀粉样前体蛋白(APP)，而β位淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)1是Aβ多肽产物的限速酶，调节Aβ肽的生成。AD病人BACE1的表达显著增高〔11〕。伴随AD的神经退行性病变与神经细胞凋亡的增加有关，这是导致认知功能障碍的一种机制〔12〕。Bcl2 存在于胞质线粒体的外壁处，作为抗细胞凋亡因子控制线粒体的渗透性来调控细胞凋亡〔13〕。在AD中许多miRNAs表现出异常表达，并且调节BACE1、Bcl2的活性。通过生物信息学分析发现，在AD模型组和野生型对照组比较中差异表达的 miRNAs，miR-128、miR-195可能通过作用于BACE1 mRNA，miR-195、miR-23a、miR-181d、miR-429可能通过作用于Bcl2 mRNA，参与对AD相关信号通路的调控。

神经营养因子，特别是BDNF可以调节中枢神经系统的发育和功能，BDNF对海马齿状回的神经形成和突触发生发挥着重要的调控作用〔14,15〕。BDNF对突触的可塑性和网络的重构起着积极的促进作用〔16〕。而且，BDNF可以通过其特异的TrkB受体调节成年海马的神经发生。众所周知，BDNF与TrkB受体结合，激活下游包括MAP/ERK在内的信号通路，并活化环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)〔17〕。已经证实增殖的齿状回前体细胞表达TrkB受体〔18〕，提示BDNF对神经发生的直接影响。通过生物信息学分析，发现在AD模型组和野生型对照组比较中差异表达的 miRNAs，miR-30c、miR-195、miR-384-5p可能通过作用于BDNF mRNA来参与对神经营养因子信号通路的调控。

海马是脑组织和学习记忆相关的关键区域。学习、记忆和习惯化依赖于海马区的突触可塑性，比如长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)等关键的细胞性活动〔19〕。脑组织的老化常常伴随着认知障碍，特别是学习记忆能力的损伤。增龄相关的学习记忆能力的降低会与中枢突触功能可塑性的损伤并行发生。实验数据证实了这一设想，因为突触可塑性的表达包括突触传递的 LTP 和 LTD 在记忆损伤的老年大鼠的脑组织发生了改变〔20〕。谷氨酸(Glu)是中枢神经系统中一种最重要的兴奋性神经递质，主要分布于大脑皮质、海马、小脑和纹状体，在学习、记忆、神经元可塑性及大脑发育等方面均起重要作用。研究证实，Glu的神经递质作用是通过兴奋性氨基酸受体而实现的，受体活性的变化、受体数目的增减都会对突触效能产生明显的影响。谷氨酸受体(GluRs)可分为离子型受体(iGluRs)和代谢型受体(mGluRs)两大类。在对LTP的研究中，人们发现这几种GluRs对LTP的诱导具有重要意义，这些受体的特异性拮抗剂不但可阻断 LTP 的诱导，而且可破坏多种学习和记忆行为〔21,22〕。近年研究表明，CREB是神经元内多条信息传递途径的汇聚点，参与长时记忆形成和突触可塑性。增龄过程中，海马CREB活性下降，影响学习记忆功能，与许多神经退行性疾病发生有关〔23〕。生物信息学分析结果发现，在AD模型组和野生型对照组比较中差异表达的miRNAs可能通过作用于mGluRs mRNA或CREB1 mRNA，参与对LTP相关信号通路的调节，进而调控中枢神经系统的学习记忆、认知和行为等多方面功能。

本研究结果提示，miRNAs 可能通过调节AD相关信号通路、神经营养因子信号通路、LTP 相关信号通路关键细胞因子的表达，参与调控中枢神经系统的生长发育、衰老退化和学习记忆等生理功能。

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〔2015-03-17修回〕

(编辑徐杰)

Microarray analysis of microRNA expression profiles in hippocampus of Alzheimer's disease and wild type mice

YANG Qun,SU Bo,ZHENG Yun,etal.

Department of Medical Function,School of Medicine,Yangtze University,Jingzhou 434023,Hubei,China

【Abstract】ObjectiveTo analyze differentially expressed miRNAs in D-galactose joint almuinim chloride(AlCl3) induced AD with wild-type mice hippocampus.MethodsKunming mice were randomly divided into AD model and wild type control groups,the model group was treated with D-galactose 90 mg·kg-1·d-1and AlCl340 mg·kg-1·d-1solution(i.p.),the control group was injection of normal saline(i.p.) once a day for 90 d.Object recognition test was used to test object recognition preference.The miRNA microarray was used to detect miRNAs expression in mice hippocampus of each group.ResultsIn the object recognition test,AD model mice showed quite less exploration time on new object (P<0.01) and significant lower discrimination index(P<0.001) compared with that of control group.Microarray analysis identified 17 differentially expressed miRNAs (≥2.0 fold up and down regulated,intersection of three sets).DAVID Functional Annotation Cluster (FAC) and pathway analysis of the target genes of miRNAs revealed confident enrichment scores for AD associated signaling pathway，neurotrophin signaling pathway and long-term potentiation pathway.ConclusionsBioinformatic analysis of the differentially expressed miRNAs have identified a number of miRNAs with putative involvement in AD development process.

【Key words】Alzheimer's disease; miRNA; Bioinformatics analysis

通讯作者：刘洋(1979-)，男，理学博士，讲师，主要从事神经退行性疾病分子机制研究。

基金项目：国家自然科学青年基金项目(No.81401095)；湖北省卫生计生青年人才项目(No.WJ2015Q045)

〔中图分类号〕R592

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0532-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.008