血管内皮生长因子-A siRNA对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制

申建刚　张定国　朱惠明

(深圳市龙华新区人民医院消化内科，广东　深圳　518000)



血管内皮生长因子-A siRNA对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响及机制

申建刚张定国1朱惠明1

(深圳市龙华新区人民医院消化内科，广东深圳518000)

〔摘要〕目的通过RNA干扰技术特异性地使人肝癌细胞株HepG2中血管内皮生长因子(VEGF)-A表达下调，检测细胞凋亡率变化及p-Akt、生成素、caspase-3表达。方法采用脂质体介导将针对靶基因VEGF-A的小片段RNA导入人HepG2细胞内，用Western印迹和RT-PCR技术检测人HepG2细胞内VEGF-A、p-Akt、生成素、caspase-3的表达，用膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术检测细胞凋亡。结果细胞转染成功后，VEGF-A siRNA组VEGF-A mRNA表达量显著降低，较RNA干扰组下降80.88%(0.26±0.07 vs 1.36±0.05，P<0.01)，VEGF-A蛋白表达量显著降低，较RNA干扰组下降75.34%(0.18±0.02 vs 0.73±0.06，P<0.01)；细胞凋亡率增加，VEGF-A siRNA组较RNA干扰组增高21.96%(28.21%±1.75% vs 6.25%±0.82%，P<0.01)。伴随p-Akt和生存素蛋白水平降低和caspase-3表达上调(P<0.01)。结论通过RNA干扰技术特异性地使人肝癌细胞株HepG2中VEGF-A表达下调，可以诱导HepG2细胞发生凋亡，这可能是通过PI3K/ p-Akt/生存素信号转导通路实现的。

〔关键词〕肝癌细胞；小干扰RNA；血管内皮生长因子；p-Akt；生存素

1深圳市人民医院消化内科

第一作者：申建刚(1974-)，男，硕士，副主任医师，主要从事胃肠病学和肝病学研究。

诱导肝癌细胞凋亡是治疗肝癌的一个重要策略。肿瘤血管生成是肿瘤发生和转移过程中的关键环节，其中血管内皮生长因子(VEGF)与其受体(VEGFR)在肿瘤血管生成中起最重要的作用〔1〕。 本研究通过RNA干扰技术抑制VEGF-A表达，观察其对肝癌细胞凋亡及生成素、p-Akt的影响，探讨其在肝癌细胞凋亡中的分子机制。

1材料与方法

1.1人肝癌HepG2细胞株细胞培养及主要试剂人肝癌HepG2细胞株接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI1640培养液(含10%的小牛血清、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/ml)，于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中常规培养。无支原体胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，RMPI-1640培养基(美国Gibco公司)，VEGF-A、p-Akt、生成素、caspase-3多克隆抗体、VEGF-A RNAi试剂盒(美国Santa Cruz公司)。RNA提取试剂盒Trizol、膜联蛋白(Annexin-V)细胞凋亡检测试剂盒(北京赛百盛基因有限公司)，RT-PCR扩增系统(美国Promega公司)。LipofectamineTM2000脂质体(Invitrogen)。实验分组：HepG2对照组、RNA干扰组和VEGF-A siRNA组。

1.2细胞转染采用阳离子脂质体介导的方法进行细胞转染，根据Lipofectamine Reagent提供的实验步骤操作。

1.3RT-PCR检测VEGF-A mRNA的表达常规Trizol法提取各标本的总RNA，紫外分光光度计测定A260和A280，以检mRNA含量和纯度，并置于-70℃保存。VEGF-A上游引物序列：5′-CCCACTGAGGAGTCCAACAT-3′，下游引物序列：5′-GAGAGATCTGGTTCCCGAAA-3′，目的片段180 bp；GAPDH上游引物序列：5′-GCCATGTACGTTGCTATCCA-3′，下游引物序列：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，目的片段293 bp。取5 μl PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下凝胶成像。结果以目的基因与GAPDH的积分吸光度的比值表示。

1.4Western 印迹检测细胞VEGF-A、p-Akt、caspase-3和生存素蛋白表达收集细胞以冷PBS清洗2次，以裂解缓冲液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取适量蛋白上样，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离，转膜，封闭，一抗、二抗反应，曝光、显影、定影，结果以目的蛋白与GAPDH积分吸光度的比值表示。

1.5Annexin V-FIYC/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术检测细胞凋亡收集细胞，加入100 μl磷酸盐缓冲液，混匀，用10 FIYC和5 PI进行染色，4℃避光作用30 min后，再加入300 μl磷酸盐缓冲液，混匀，将细胞置激发光为488 nm波长的FACS Calibur型流式细胞仪检测。ModFit LT软件分析结果。

1.6统计学分析采用SPSS19.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1RNAi下调HepG2细胞中VEGF-A的表达HepG2对照组和RNA干扰组VEGF-A mRNA表达量比较无明显差异(1.26±0.02 vs 1.36±0.05)；VEGF-A siRNA组VEGF-A mRNA为0.26±0.07，显著低于RNA干扰组(P<0.01)，见图1。HepG2对照组和RNA干扰组VEGF-A蛋白表达量比较无明显差异(0.86±0.07 vs 0.73±0.06)；VEGF-A siRNA组VEGF-A蛋白表达为0.18±0.02，显著低于RNA干扰组，P<0.01，见图2。

1~3：HepG2对照组、RNA干扰组、VEGF-A siRNA组，下图同图1　RT-PCR 检测RNA干扰技术沉默VEGF-A

图2　Western印迹检测RNA干扰技术沉默VEGF-A

2.2VEGF-A表达下调促进HepG2/siRNA细胞凋亡HepG2对照组和RNA干扰组的凋亡率分别为5.43%±0.18%和6.25%±0.82%，均明显低于VEGF-A siRNA组的28.21%±1.75%，VEGF-A siRNA组较RNA干扰组增高21.96%。

2.3VEGF-A表达下调抑制p-Akt和生成素蛋白水平表达HepG2对照组和RNA干扰组p-Akt蛋白表达量比较无明显差异(3.78±0.38 vs 4.13±0.47)；VEGF-A siRNA组p-Akt蛋白表达量为0.57±0.06，较RNA干扰组显著降低(P<0.01)。HepG2对照组和RNA干扰组生存素蛋白表达量比较无明显差异(0.38±0.07 vs 0.31±0.02)；VEGF-A siRNA组生存素蛋白表达量为0.11±0.02，较RNA干扰组下降64.52 %(P<0.01)(图3)。

图3　蛋白印迹技术检测生存素表达

2.4VEGF-A表达下调促进caspase-3蛋白水平表达HepG2对照组和RNA干扰组caspase-3蛋白表达量比较无明显差异(0.54±0.04 vs 0.62±0.04)；VEGF-A siRNA组caspase-3蛋白表达量为3.43±0.36，较RNA干扰组显著升高(P<0.01)(图4)。

图4　Western印迹技术检测p-Akt和caspase-3表达

3讨论

VEGF家族成员包括VEGF-A (即通常所指的VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E等。VEGF在许多肿瘤组织中有高表达，目前发现VEGF对肿瘤的影响机制可能有：① 促进肿瘤血管形成，这与VEGF能增加血管通透性、促进血管内皮细胞增殖、促进血管支持物生长有关；②促进肿瘤淋巴管生长；③ 对肿瘤细胞的细胞动力影响；④ 增强肿瘤细胞对放疗的耐受性及影响免疫功能等〔2〕。

目前VEGF对肿瘤细胞增殖的影响还存在着争论，但对抑制肿瘤细胞的凋亡作用已获得了一定的共识〔3〕，其机制尚不明确。本实验使用小RNA干扰方法，下调人肝癌HepG2细胞中VEGF-A的表达，可以诱导肝癌HepG2细胞凋亡，并检测到caspase-3表达增加，从而证实抑制VEGF-A表达可通过caspase-3途径诱导HepG2细胞凋亡。

近年来，P13K/Akt/生存素信号通路逐渐为人们所熟悉〔3,4〕。P13K/Akt信号通路是体内重要的信号转导通路之一，在维持细胞生长、分化、代谢等方面起着关键作用。Akt是一类调节细胞凋亡/存活的丝氨酸/苏氨酸激酶，Akt作为一潜在的癌基因，Akt的异常表达与肿瘤的发生、发展以及对放化疗产生的耐药性密切相关〔5〕，作为凋亡抑制蛋白(IAPs)家族的新成员〔6〕，生存素在细胞增殖、凋亡的平衡中起重要的调控作用，生存素可通过抑制凋亡通路下游的caspase-3和caspase-7发挥抗凋亡作用，其潜在的临床意义是肝癌早期诊断、判断转移、评估预后及预测对放化疗的敏感性等，并成为抗肿瘤治疗的一个新靶点。

近年来，在实体瘤中VEGF和生成素表达相关性已受到越来越多的重视。研究证实〔7~9〕，VEGF可通过上调生成素表达促进血管内皮细胞增殖；VEGF在肿瘤血管生成过程中的内皮细胞抗凋亡作用依赖于其诱导的生成素表达增加，高表达的生成素抑制caspase的凋亡途径，使内皮细胞免于凋亡；生成素的反义寡核苷酸可抵消VEGF的抗凋亡作用，导致内皮细胞凋亡增加及毛细血管退化〔10〕。上述结果表明，VEGF与生成素之间有密切的关系。对VEGF及生存素在人HepG2细胞中表达相关性的研究不多。本研究发现，VEGF-A在基因水平和蛋白水平表达下降时生存素蛋白表达也随之下调，并可检测到p-Akt的表达下调。由此推测VEGF-A对生存素表达具有调控作用，这可能是通过P13K/Akt/生存素信号通路实现的。

综上所述，本实验发现在人HepG2细胞内下调VEGF-A表达，可以诱导HepG2细胞凋亡，这可能是通过抑制P13K/Akt/生存素信号转导通路表达实现的，这将为临床选择新的治疗靶点提供理论依据。

4参考文献

1Ferrar N,Gerber HP,LeCouter J．The biology of VEGF and its receptors 〔J〕.Nat Med,2003;9(6):669-76.

2Ebos JM,Lee CR,Kerbel RS.Tumor and host-mediated pathways of resistance and disease progression in response to antiangiogenic therapy〔J〕.Clin Cancer Res,2009;15(16):5020-5.

3Tolosa L,Mir M,Asensio VJ,etal.Vascular endothelial growth factor protects spinal cord motoneurons against glutamate-induced excitotoxicity via phosphatidylinositol 3-kinase〔J〕.J Neurochem,2008;105(4):1080-90.

4Xiong YQ,Sun HC,Zhu XD,etal.Bevacizumab enhances chemosensitivity of hepatocellular carcinoma to adriamycin related to inhibition of survivin expression 〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2011;137(3):505-12.

5Nicholson KM,Anderson NG.The protein kinase B/Akt signaling pathway in human malignancy〔J〕.Cell Signal,2002;14(5):381-95.

6Mita AC,Mita MM,Nawrocki ST,etal.Survivin:key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics 〔J〕.Clin Cancer Res,2008;14(16):5000-5.

7崔斐，陈斌，陈锦章，等.凋亡抑制蛋白Survivin和血管内皮生长因子在肝细胞癌中的表达及其临床意义〔J〕.南方医科大学学报，2008；28(5)：7610-3.

8Beierle EA,Nagaram A,Dai W,etal.VEGF-mediated survivin expression in neuroblastoma cells〔J〕.J Surg Res,2005;127(1):21-8.

9Kanwar JR,Kamalapuram SK,Kanwar RK.Targeting survivin in cancer: the cell-signalling perspective〔J〕.Drug Discov Today,2011;16(11-12):485-94.

10Chun JY,Hu Y,Pinder E,etal.Selenium inhibition of survivin expression by preventing Sp1 binding to its promoter 〔J〕.Mol Cancer Ther,2007;6(9):2572-80.

〔2014-03-17修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

基金项目：深圳市科技计划项目(No.201003021)

〔中图分类号〕R363

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0542-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.011