脑通汤含药血清对缺氧/复氧大鼠海马神经元抗氧化应激相关指标的影响

何　筑　况时祥　张树森　邹家莉　杨　燕　崔冬冰

(贵阳市第三人民医院，贵州　贵阳　550002)



脑通汤含药血清对缺氧/复氧大鼠海马神经元抗氧化应激相关指标的影响

何筑况时祥1张树森1邹家莉1杨燕2崔冬冰2

(贵阳市第三人民医院，贵州贵阳550002)

〔摘要〕目的探讨脑通汤通过海马神经元抗氧化应激治疗血管性痴呆(VD)的机制。方法培养大鼠原代海马神经元及鉴定，取培养9 d的神经元，随机分为正常细胞组、缺氧/复氧模型组、正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组。除正常细胞组以外，各组均置入(95%N2+5%CO2)混合气体的三气培养箱缺氧24 h再复氧2 h造模。采用MTT法检测缺氧24 h和复氧2 h时间点海马神经元活性并计算细胞存活率；实时荧光定量PCR法检测海马神经元核因子-E2-相关因子(Nrf)2、血红素氧合酶亚型(HO)-1、醌氧化还原酶(NQO)1 mRNA的表达。结果MTT显示：缺氧24 h：模型组的海马神经元活性及存活率较正常细胞组明显下降(P<0.05)，与正常血清组及脑通汤不同剂量含药血清组比较无明显差异(P>0.05)。复氧2 h：脑通汤不同剂量含药血清组均较模型组明显升高(P<0.05)，正常血清组较模型组无明显差异(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果显示：脑通汤含药血清能够促进缺氧/复氧海马神经元抗氧化应激相关基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达(P<0.05)，并且脑通汤含药血清大剂量组与中剂量组的上述3个基因水平明显高于缺氧/复氧模型组(P<0.01)。结论脑通汤可通过上调抗氧化相关基因 Nrf2、HO-1、NQO1的表达，减轻海马神经元缺氧/复氧损伤的氧化应激反应，从而保护大鼠海马神经元缺氧/复氧损伤。

〔关键词〕脑通汤；海马神经元；缺氧/复氧；抗氧化应激

1贵阳中医学院第二附属医院

2贵阳医学院组织工程与干细胞实验中心

第一作者：何筑(1986-)，女，硕士，主要从事血管性痴呆研究工作。

血管性痴呆(VD)是唯一可防治的痴呆，尤其是早期治疗的可逆性备受关注〔1〕。目前，中医药在治疗VD方面的优势和特色日益突显〔2〕。况时祥教授通过长期研究，筛选出黄芪、西洋参、水蛭、葛根、天麻等中药，组成具有补气升阳、化瘀通络、潜降浮阳之功的脑通汤〔3〕。氧化应激是脑缺血再灌注损伤的重要环节，在缺血性脑损伤中发挥着重要作用〔4〕。已有研究报道，体外培养的神经细胞缺氧/复氧(H/R)过程中的病理生理改变类似于体内的缺血/再灌注损伤〔5〕。本实验拟探讨脑通汤对H/R海马神经元抗氧化应激的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物出生24 h以内SD雄性大鼠，SPF 级，购自贵阳医学院实验动物中心，合格证号：SCXK(黔)2012-0001。SD雄性SPF级大鼠，体重(200+20)g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证号SCXK(渝)2012-0005。

1.1.2主要试剂与药品L-谷氨酰胺；Neurobasal-A Medium；B27无血清添加剂、无糖DMEM均购于美国Gibco 公司；多聚-L-赖氨酸(PLL)、DMEM-F12培养基、0.25%胰酶、青、链霉素双抗溶液均购于HyCLone；胎牛血清(FBS，杭州四季青)；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(北京中杉金桥公司)；异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG、兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)多克隆抗体均购于武汉博士德生物工程有限公司；MTT、二甲基亚砜、台盼蓝染液(Sigma)；Trizol(批号1596-026，invitrogen公司)；SYBR Green PCR 试剂盒(批号K0223，Thermo公司)；逆转录试剂盒(批号K1622，Fermentas公司)；异丙醇、无水乙醇、氯仿均购于国药集团化学试剂公司；水合氯醛(天津市富宇精细化工有限公司)；脑通汤主要成分(黄芪40 g、西洋参8 g、天麻20 g、水蛭24 g、葛根60 g)均由贵阳中医学院第二附属医院中药房提供。

1.1.3主要仪器设备SW-CJ-1D超净工作台(苏州净化设备有限公司)；LD4-2低速离心机 (北京医用离心机厂)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；Galaxy170R三气培养箱(英国New Brunswick)；CTH4-200荧光显微镜(日本Olympus公司)；TE2000倒置显微镜(日本Nikon)；MIAS 图像分析系统(四川大学图像图形研究所提供)，ABI-7300Real-time检测仪(ABI公司)；TG-16M低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；K30旋涡振荡器(青浦泸西仪器厂)；PRO200电动匀浆机(FLUKO)；Tanon 2500R全自动数码凝胶成像分析系统、Tanon HE-120水平电泳槽、Tanon EPS300电泳仪均为(上海天能公司)，K2800核酸检测仪(北京凯恩公司)。

1.2方法

1.2.1脑通汤含药血清的制备

1.2.1.1脑通汤药物的制备脑通汤每剂方药152 g，加水500 ml煎制，醇沉提取，高温消毒，制成浸膏含生药量为3.04 g/ml(大剂量脑通汤组)、1.52 g/ml(中剂量脑通汤组)、0.76 g/ml(小剂量脑通汤组)，4℃冻存备用。

1.2.1.2分组SD大鼠60只，随机分为正常对照组和大、中、小剂量脑通汤组每组15只。参照《药理实验方法学》〔6〕换算出灌胃给药量：大、中、小剂量脑通汤组分别为每日15.2、7.6、3.8 g/kg，正常对照组每日灌服生理盐水10 ml/kg〔7〕，2次/d，连续灌胃4 d。

1.2.1.3脑通汤含药血清采集末次给药2 h后，10%水合氯醛(0.33 ml/100 g) 麻醉，无菌股动脉采血，常温静置4 h，3 000 r/min离心20 min，分离血清，混匀同组血清，0.22 μm滤膜过滤除菌，56℃水浴箱中灭活30 min，标记制得的血清分别称为正常血清及脑通汤大、中、小剂量含药血清，-20℃保存备用。

1.2.2海马神经元原代培养及鉴定 参考文献〔8〕方法。选择10只出生24 h以内SD大鼠，脱颈处死，浸泡于75%酒精中1 min，断头，于显微镜下剥离双侧海马，放入预冷的D-hank液中冲洗2~3遍。将组织剪成1 mm3左右大小的组织块，用移液枪转移至15 ml离心管中，按照1∶2比例加入0.25%胰蛋白酶。于37℃，5%CO2培养箱中消化15 min，每5 min晃荡一次。消化完毕加入同等体积的种植培养基(89%DMED-F12、10%胎牛血清和1%双抗)，终止消化5 min，再200目筛网过滤制成细胞悬液，800~1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量种植培养基，吹打混匀制成细胞悬液。放入培养箱差速贴壁1 h，收获贴壁速度较胶质细胞慢的神经元，台盼蓝拒染试验，血球计数板显微镜下计数胞体透亮的活细胞，按1.0×105~1.0×106个/ml的密度接种于PLL包被过的六孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱内孵育。24 h后，第一次全量换成无血清培养基(97%Neurobasal、2%B27和1% L-谷氨酰胺)继续孵育，每隔2~3 d换液1次。取生长9 d的海马神经用NSE做免疫荧光鉴定其纯度。

1.2.3海马神经元分组取生长9 d的海马神经元，随机分为正常细胞组：正常海马神经元；H/R模型组：海马神经元+H/R；正常血清组：海马神经元+H/R+正常血清组；脑通汤大剂量含药血清组：海马神经元+H/R+脑通汤大剂量含药血清组；脑通汤中剂量含药血清组：海马神经元+H/R+脑通汤中剂量含药血清组；脑通汤小剂量含药血清组：海马神经元+H/R+脑通汤小剂量含药血清组。

1.2.4海马神经元H/R模型的建立10% 正常血清及10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基的配制：分别用89%无胎牛血清的DMEM培养基、1%双抗和10% 正常血清及10%不同剂量含药血清配制而成。

除正常细胞组以外均参考文献〔9〕，根据本课题的具体要求稍加改良，制备细胞H/R模型：用无糖DMEM洗涤2次，H/R模型组换液无血清培养基，其余各组于I/R时依次加入无FBS配制而成的含10%SD大鼠正常血清及含10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基，将这5组全置入37℃三气培养箱，持续通入(95%N2+5%CO2)混合气体，流速保持在0.5 L/min，缺氧24 h。H/R模型组换液无血清培养液继续培养，其余四组全量换液相应含10%SD大鼠正常血清及10%脑通汤大、中、小剂量含药血清培养基，再将这5组放回37℃、5%CO2培养箱持续复氧2 h。正常细胞组用无血清培养基正常培养26 h，不做任何处理。

1.2.5四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定海马神经元的活力将海马神经元以5×105/ml的细胞密度接种于96孔板中，取生长9 d的海马神经元分别进行缺氧24 h和复氧2 h时间点造模，吸弃96孔板各孔液体，每孔加MTT(5 mg/ml)20 μl，混匀，37℃孵育4 h。弃上清液，每孔加100 μl的二甲基亚砜，均匀振荡10 min，用酶标仪(微量波长为570 nm)处读取吸光度值(OD值)，用OD值以表示神经元活性。细胞存活率以正常细胞组OD值均数为100%，计算公式：细胞存活率(%)=各孔OD值/正常组OD值均数×100%。

1.2.6实时荧光定量PCR法检测海马神经元核因子-E2-相关因子(Nrf)2、血红素氧合酶亚型(HO)-1、醌氧化还原酶(NQO)1 mRNA的表达各引物均由上海基尔顿生物科技有限公司设计。Nrf-2 mRNA，上游引物：5′GACTCAAATCCCACCTTGAAC 3′，下游引物：5′CTTTACACAGGGACAGATCAC3′，扩增长度166 bp；HO-1 mRNA，上游引物：5′GGTCCTCACACTCAGTTTC 3′，下游引物：5′CAGGCATCTCCTTCCATTC 3′，扩增长度226 bp；NQO1 mRNA，上游引物：5′GGAAGAAGCGTCTGGAGACTG 3′，下游引物：5′TGGTTGTCGGCTGGAATGG 3′，扩增长度184 bp，内参β-actin mRNA，上游引物：5′GTCGGTGTGAACGGATTTG 3′，下游引物：5′TCCCATTCTCAGCCTTGAC 3′，扩增长度181 bp。按Trizol试剂说明书提取海马神经元总RNA，将细胞总RNA逆转录合成cDNA，将逆转录的cDNA按照SYBR Green PCR 试剂盒说明操作进行实时荧光定量RT-PCR反应(两步法)进行目的基因和内参基因的实时荧光定量PCR反应。反应总体积25 μl，PCR反应参数：预变性，95℃，10 min，变性 95℃，15 s，退火60℃，45 s，延伸60℃，1 min，总共40次循环。反应结束时仪器自动显示达到阈值时的循环圈数(CT)值。由电脑自带软件与实时荧光定量PCR反应软件ABI Prism 7300SDS Software自动输出结果及PCR扩增产物生成曲线，以内参β-actin mRNA CT值标化Nrf2、HO-1及NQO1 mRNA的 CT值，运用2-△△CT方法计算样本目的基因相对表达量〔10〕。公式：样品目的基因△CT=样品目的基因CT值-内参基因CT值；△△CT =样品目的基因△CT值-对照组△CT值。

1.3统计学方法应用SPSS17.0软件行单因素方差分析、t检验。

2结果

2.1海马神经元形态学观察及鉴定倒置显微镜下观察：24 h后细胞几乎贴壁并有细小的突起伸出，长短不一。培养3 d后，细胞形态多样化，以不规则形为主，突起较前明显增多增粗并延长，有逐渐靠拢趋势，有部分交织成稀疏的网状突起联系。培养5~7 d，神经元胞体明显增大丰满，趋于成熟，突起及分枝进一步增长增粗靠近明显，相互交织成较稠密的神经突起网络。第9~10天后神经元胞体增大饱满，完全成熟，神经元突起间更加紧密连接成致密网络状，可见少许的细胞碎片。NSE免疫荧光鉴定：神经元胞体饱满，轴突明显趋于成熟。NSE免疫荧光染色后，阳性细胞胞体及轴突在荧光显微镜下呈亮绿色，计算海马神经元纯度为 94.5%+2.5%。见图1，图2。

2.2脑通汤对海马神经元缺氧24 h及复氧2 h后活性及存活率的影响组间比较：缺氧24 h：H/R模型组、脑通汤不同剂量含药血清组、正常血清组的海马神经元活性及存活率均较正常细胞组明显下降(P<0.05)，这五组间比较无明显差异(P>0.05)；复氧2 h：H/R模型组、脑通汤不同剂量含药血清组、正常血清组的海马神经元活性及存活率仍均较正常细胞组明显下降(P<0.05)，脑通汤不同剂量含药血清组均较模型组明显升高(P<0.05)，正常血清组较模型组无明显差异(P>0.05)。组内比较：H/R模型组、脑通汤不同剂量含药血清组、正常血清组的海马神经元活性及存活率均较缺氧24 h明显升高(P<0.05)。见表1。

图1　原代海马神经元形态学观察(倒置显微镜，×400)

图2　NSE免疫荧光鉴定(荧光显微镜，×400)

组别缺氧24h活性(OD值)存活率(%)复氧2h活性(OD值)存活率(%)正常细胞组0.766±0.142100±00.778±0.132100±0H/R模型组0.324±0.0641)57.64±5.241)0.357±0.07561)3)64.54±5.172)3)正常血清组0.329±0.0741)59.47±5.371)0.387±0.0822)3)65.87±5.342)3)脑通汤大剂量含药血清组0.344±0.0871)59.45±6.871)0.754±0.08611)3)83.58±6.952)3)脑通汤中剂量含药血清组0.359±0.0481)61.04±6.551)0.672±0.0781)3)76.28±6.952)3)脑通汤小剂量含药血清组0.377±0.0741)62.37±5.381)0.615±0.0841)3)67.54±5.472)3)

与同一时间点正常细胞组比较：1)P<0.05；与同一时间点模型组比较：2)P<0.05；与缺氧24 h比较：3)P<0.05

2.3脑通汤含药血清对海马神经元H/R后Nrf-2、HO-1及NQO1基因的影响实时荧光定量PCR显示：与正常细胞比较，H/R模型组Nrf-2、HO-1、NQO1 mRNA的表达量明显下降(P<0.05)。与H/R模型组比较，正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组的Nrf-2、HO-1、NQO1 mRNA的表达量呈现上升趋势(P<0.05)，其中脑通汤大、中剂量含药血清组上升最显著(P<0.01)。见表2。

表2　各组Nrf-2、HO-1、NQO1 mRNA表达水平比较

与正常细胞组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01

3讨论

氧化应激是指机体氧化与抗氧化物质失衡从而引起的组织细胞的氧化损伤〔11〕，参与并介导缺血再灌注损伤的重要环节〔12〕，可导致神经细胞凋亡、血脑屏障损伤及脑水肿〔13〕。缺血性脑血管病是VD的主体病因〔14〕，脑缺血再灌注损伤是缺血性脑血管病发生发展的重要重要环节，因此可见，氧化应激是参与脑缺血所致VD发病的重要病理生理基础。Nrf2、HO-1、NQO1是参与氧化应激与抗氧化应激反应的常见分子标志物。 目前，在众多参与氧化应激反应的防御性转导通路之中，Nrf2/ARE是最重要的氧化应激通路。Nrf2不仅是氧化应激的感受器，还是细胞氧化应激反应中的核心转录因子，生理状态下，Nrf2转录被负性调节蛋白Keap1抑制，在机体受到氧化应激时，导致Nrf2与Keap1解离而活化进入细胞核，与抗氧化反应元件(ARE)结合相互作用，诱导下游靶基因，如：Ⅱ相解毒酶基因：NQO1、抗炎因子类基因：HO-1等表达〔15〕。因此，激活Nrf2基因的表达是对抗氧化应激反应的关键。HO-1为诱生型，广泛分布于全身组织细胞中，可以通过上调体内HO-1的表达，发挥其脑保护作用。袁野等〔16〕研究等证实：通过上调小鼠脑缺血再灌注损伤中 HO-1蛋白表达，从而提高机体抗氧化水平，可以保护缺血再灌注后的脑损伤。邵建林等〔17〕实验进一步证实，可以通过七氟烷诱导大鼠海马组织HO-1基因的表达，保护缺血再灌注损伤的海马神经元。由此可见，激活HO-1的高表达，是保护缺血再灌注损伤的海马神经元的一种重要途径。黄小平等〔18〕进一步证实，在脑缺血/再灌注后，通过黄芪甲苷分别与三七的三种有效成分配伍可以有效激活Nrf2/HO-1信号通路，促进Nrf2的合成及相细胞内核转位，激活并促进下游抗氧化靶基因HO-1等的表达，从而减轻小鼠脑缺血/再灌注后脑组织氧化应激损伤。NQO1是氧化应激Nrf2/ARE通路激活的重要下游靶基因，属于Ⅱ相解毒酶基因。在缺血再灌注损伤中，可以通过激活Nrf2/ARE信号通路，上调Nrf2、NQO1蛋白分子的表达，增强脑组织抗氧化反应，从而保护大鼠脑缺血再灌注损伤的神经细胞〔19〕。

本课题组前期临床及实验证实〔3〕，本方不仅可以改善VD早期患者认知功能，改善VD大鼠学习及记忆能力，还可减轻VD大鼠海马CA1区的神经细胞及椎体细胞凋亡。本文结果进一步说明脑通汤含药血清对H/R损伤下的海马神经元具有保护作用，提示脑通汤干预海马神经元，缺氧24 h复氧2 h是最佳的干预时间。实时荧光定量PCR结果说明，H/R损伤后细胞处于氧化应激状态，此时激活Nrf2通路，进而诱导下游靶基因HO-1、NQO1 mRNA较正常细胞组升高；细胞经过脑通汤含药血清干预后，脑通汤不同剂量含药血清组上述3个基因的表达又较模型组明显增高，提示脑通汤对H/R模型敏感，能诱导激活Nrf2通路，进而诱导下游靶基因HO-1、NQO1 mRNA表达升高，增强细胞对抗氧化应激反应的耐受性。

本研究结果显示，脑通汤对大鼠海马神经元H/R损伤具有保护作用，其作用机制是通过激活海马神经元Nrf2通路，诱导下游靶基因HO-1、NQO1mRNA的进一步表达，为VD的临床治疗提供进一步实验基础及理论依据。

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〔2015-05-28修回〕

(编辑袁左鸣)

Effect of Naotong soup medicinal serum on anti-oxidative stress-related indicators of hippocampal neurons in rats after hypoxia/reoxygenation

HE Zhu,KUANG Shi-Xiang,ZHANG Shu-Sen，etal.

Third People's Hospital of Guiyang，Guiyang 550000，Guizhou，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate Naotong soup treated vascular dementia by hippocampal neurons against oxidative stress.MethodsPrimary hippocampal neurons were cultured and indentified. Neurons cultured for 9 days were randomly divided into normal cell, hypoxia/reoxygenation(H/R)model, normal serum, large, medium and small doses of Naotong soup medicinal serum groups.The activity and the survival rate of neurons both at 24 hours after hypoxia and 2 hours after reoxygenation were evaluated by colorimetric MTT assay. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expressions of nuclear factor erythroid-derived factor 2-related factor(Nrf2)，Heme Oxygenase(HO)-1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase(NQO1)mRNA.ResultsCompared with those of normal cell group，hippocampal neuronal activity and the survival rate of model groups were significantly lower after hypoxia 24 h(P<0.05), between normal serum group and different dose of Naotong soup medicinal serum groups, they had no significant differences (P>0.05). Compared with those of model group, they had significantly increased after reoxygenation 2 h in different dose of Naotong soup medicinal serum groups(P<0.05)and in normal serum group they had no significant difference(P>0.05). Naotong soup medicinal serum promoted the expressions of Nrf2, HO-1, NQO1 of hippocampal neurons(P<0.05),and these three genes were significantly higher than those of model group(P<0.05).ConclusionsNaotong soup could increase the expressions of Nrf2, HO-1 and NQO1 and reduce oxidative stress of hippocampal neurons after H/R. So it could protect hippocampal neurons in rats after H/R.

【Key words】Naotong soup; Hippocampal neurons; Hypoxia / reoxygenation; Antioxidative stress

通讯作者：况时祥(1962-)，男，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事中西医结合防治老年痴呆临床与基础研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81160490)

〔中图分类号〕R74

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0526-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.006