β-淀粉样蛋白诱导HT22细胞建立阿尔茨海默病细胞模型

孙凤芹　罗红波　张菲菲　程艳伟　石向群

(兰州军区兰州总医院神经内科，甘肃　兰州　730050)



β-淀粉样蛋白诱导HT22细胞建立阿尔茨海默病细胞模型

孙凤芹罗红波张菲菲程艳伟石向群

(兰州军区兰州总医院神经内科，甘肃兰州730050)

〔摘要〕目的探讨β-淀粉样蛋白(Aβ25~35)诱导HT22细胞建立阿尔茨海默病(AD)细胞模型。方法将HT22 细胞分为未分化组和分化组，未分化组加入完全培养基培养48 h，分化组为完全培养基贴壁生长24 h后加入分化液(Neurobasal 培养基和N2添加剂)培养24 h，Western印迹检测两组细胞ATF6、PERK、IRE1蛋白表达量的变化。不同浓度的Aβ25~35分别作用于两组HT22细胞24 h，用MTT测定细胞活力变化。结果ATF6、PERK、IRE1蛋白在未分化组的表达量明显高于分化组。Aβ25~35对未分化组细胞虽有损伤作用，但各组间无明显差异，且无剂量依赖关系。Aβ25~35可以诱导分化组HT22细胞发生损伤，且呈剂量依赖关系，Aβ25~35(20 μmol/L、40 μmol/L)作用于分化组HT22细胞24 h，细胞存活率分别为66%、60%，AD模型最佳。结论Aβ25~35(20 μmol/L)诱导分化型HT22细胞可建立最佳AD细胞模型。

〔关键词〕β-淀粉样蛋白；HT22细胞；阿尔茨海默病细胞模型

第一作者：孙凤芹(1989-)，女，在读硕士，主要从事脑血管病研究。

建立良好的阿尔茨海默病(AD)模型有助于从细胞和分子水平进一步研究AD的发病机制和治疗方法。现常用β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导细胞反应建立AD模型，主要涉及原代培养神经元、神经嵴源细胞、神经胶质细胞、非神经细胞、基因工程细胞及杂交组织细胞等〔1〕。HT22细胞是HT4细胞的亚克隆，为一种永生化的小鼠海马神经元细胞，具有生长稳定、易获得的特点。在体外研究的情况下，分化液处理后的HT22细胞，轴突、树突变得更长，细胞更接近体内海马神经元的状态〔2〕。MTT检测细胞活力时，加入抑制细胞生长类药物后，细胞存活率为60%~80%时，细胞模型建立成功〔3〕。本实验研究不同浓度Aβ25~35分别诱导两组细胞建立细胞模型后细胞活力的变化。

1材料与方法

1.1实验材料与仪器HT22细胞株购自广州吉妮欧公司；Aβ25~35购自Sigma公司；MTT、二甲基亚砜购自Amersco公司；DMEM高糖培养基购自Hyclone公司；2.5 g/L胰蛋白酶、Neurobasal培养基和N2添加剂均购自Gibco 公司；MTT为国产分析纯试剂。主要仪器包括德国memmert公司恒温CO2培养箱，奥林巴斯TH4-200倒置荧光显微镜，瑞士Tecan Infinite M200型多功能酶标仪。

1.2细胞培养、分化及药物处理HT22细胞隔4 d传一代，传代前一天半量换液。HT22细胞未分化组为不添加任何药物的等体积的完全培养基。HT22细胞分化组为完全培养基传代培养24 h后，加入分化液进行细胞分化处理24 h〔4，5〕。Aβ25~35使用前1 w取出至37℃孵育，10 d后取出分别用完全培养基和分化液稀释至工作浓度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L。

1.3蛋白印迹法检测ATF6、PERK、IRE1蛋白表达将分化组和未分化组(两组均未加入Aβ25~35)细胞培养后加入冷PBS洗2次后加入细胞裂解液进行裂解，离心弃沉淀，吸出上清液用BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS上样缓冲液混匀，100℃变性5 min，行10%和8% SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。4℃孵育一抗anti-ATF6(1∶1 000)、anti-PERK(1∶500)、anti-IRE1(1∶500)过夜。TBST洗膜4次，每次8 min，室温下孵育二抗(1∶5 000)2 h，TBST洗膜4次，每次8 min，使用美国UVP ChemiDoc-It化学发光成像系统曝光，ipp软件进行分析。

1.4细胞活力测定取对数生长的HT22细胞，以8×103/孔的密度种植至96孔细胞培养板中，未分化组细胞贴壁生长48 h后，弃完全培养基，加入不完全培养基稀释不同浓度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)；分化组细胞传代后加入完全培养基培养24 h后，加入分化液进行细胞分化处理24 h后，弃分化液，加入分化液稀释的不同浓度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，24 h后每孔加入20 μl的MTT 5 mg/ml试剂，于37℃、体积百分数为5%CO2培养箱内温育4 h，弃掉培养基，每孔加入DMSO 150 μl，用酶标仪于490 nm波长处测定各孔的吸光度，扣除空白孔中本底的吸光度，结果以各处理组与阳性对照组的比值作为相对细胞活力。

1.5统计学处理采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1两组细胞ATF6、PERK、IRE1蛋白表达量的变化未分化组ATF6、PERK、IRE1蛋白表达量较分化组明显增多。见图1。

图1　内质网应激蛋白在分化组与未分化组表达情况

2.2HT22细胞活力

2.2.1未分化型HT22细胞活力测定当不同浓度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)作用于完全培养基培养下的未分化型HT22细胞，HT22细胞活力无明显的剂量依赖关系；而且无论Aβ25~35剂量多少，只要加入培养基中，细胞便会出现大量的死亡。见图2。

图2　MTT法测定Aβ25~35对未分化型及分化型HT22细胞活力的影响

2.2.2分化型HT22细胞活力测定当不同浓度的Aβ25~35(0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)作用于分化液处理后的分化型HT22细胞，HT22细胞活力呈剂量依赖性下降(P<0.05)，高浓度的Aβ25~35对细胞有明显的毒性作用，随浓度减低细胞毒性作用减低。当Aβ25~35(20 μmol/L)作用于分化型HT22细胞24 h，细胞存活率为66%，细胞模型最佳。见图2。

3讨论

Aβ由39～43个氨基酸组成，其活性片段主要在第 25～35个氨基酸残基。Aβ具有神经营养和神经毒性的双重生物活性。Aβ在较高浓度时，对HT22细胞的神经毒性作用远大于神经营养作用〔6〕。

本实验培养细胞时，在参照文献〔2~4〕的基础上进行了进一步的改进：①胎牛血清的浓度为8%，②96孔板种植细胞的浓度为8×103/孔，③以1∶4传代，④未加青霉素-链霉素双抗，⑤用0.9的生理盐水稀释Aβ25~35。反复培养HT22细胞发现，HT22细胞传代非常稳定，且繁殖能力很强，适当降低血清浓度、减少种植密度可以减慢细胞生长速度，促进细胞长出轴突、树突，充分表现出神经元的特性。未加双抗，细胞未发生污染，且避免了对细胞的损伤作用。Aβ25~35可以溶解在生理盐水里，第二次溶解时出现少量的不溶物，加入少量的酸后完全溶解。特殊说明的是，HT22细胞传代时，用胰酶消化后，显微镜下观察细胞轴突树突消失，细胞彼此分离开后，弃胰酶加入完全培养基，反复吹打至少100次，不需进行离心，以1∶4传代，第二日观察细胞单个分布，生长状态良好。

本实验表明未分化型细胞处于应激活跃状态，与HT22细胞体内状态差距较大，不易建立细胞模型。HT22细胞未分化状态下，Aβ25~35对其有损伤作用，但无剂量依赖关系；而分化型细胞加入Aβ25~35后，细胞活力出现剂量依赖性的下降。

综上，我们认为在建立 AD 细胞模型时，选用20、40 μmol/L Aβ25~35作用于分化型HT22细胞24 h，从生化特性、细胞活力及形态学改变等角度，可作为较理想的AD细胞模型。

4参考文献

1Lloret A，Fuchsberger T，Giraldo E，etal.Molecular mechanisms linking amyloid β toxicity and Tau hyperphosphorylation in Alzheimer′s disease〔J〕.Free Radic Biol Med,2015；83(2)：186-91.

2Zhao Z，Lu R，Zhang B，etal.Differentiation of HT22 neurons induces expression of NMDA receptor that mediates homocysteine cytotoxicity〔J〕.Neurol Res,2012；34(1)：38-43.

3张云鹤，张一娜，刘歆,等.Aβ1~42诱导原代海马神经细胞建立阿尔茨海默病细胞模型〔J〕.中国老年学杂志,2011；31(11)：2027-9.

4Liu J，Li L，Suo WZ.HT22 hippocampal neuronal cell line possesses functional cholinergic properties〔J〕.Life Sci,2009；84(9-10)：267-71.

5Suo Z，Wu M，Citron BA，etal.Rapid tau aggregation and delayed hippocampal neuronal death induced by persistent thrombin signaling〔J〕.J Biol Chem,2003；278(39)：37681-9.

6张蓓，谷贝贝，范胜诺,等.β-淀粉样蛋白Aβ25~35诱导HT22细胞自噬及其对V-ATPase表达的影响〔J〕.中山大学学报,2013；34(1)：1-5.

〔2015-12-29修回〕

(编辑袁左鸣/徐杰)

Aβ25~35induced HT22 cells to become AD cells model

SUN Feng-Qin, LUO Hong-Bo, ZHANG Fei-Fei,etal.

Department of Neurology, Lanzhou General Hospital Lanzhou Command, Lanzhou 730050, Gansu, China

【Abstract】ObjectiveTo explore Aβ25~35induced HT22 cells to establish AD cells model.MethodsHT22 was divided into undifferentiated and differentiated groups.The undifferentiated group was cultured for 48 hours with complete culture medium.The differentiated group was cultured for 24 hours with complete culture medium , following the differentiation medium (Neurobasal medium and N2 additive) was added for 24 hours.The expressions of IRE1, PERK and ATF6 in the two groups were detected by Western blot.ResultsThe expressions of ATF6, PERK and IRE1 in undifferentiated group were significantly higher than those in differentiation group. Aβ25~35on undifferentiated group cell was injured, but the injury was not in accordance with the increase of drug concentration increased. Aβ25~35induced differentiation of HT22 cells that were damaged, and the damage was in accordance with the increase of drug concentration increased. Aβ25~35(20,40 μmol/L) effects on HT22 cell differentiation for 24 hours,which the cell survival rate were 66% and 60%.In this case, the establishment of the cell model was the best AD model.ConclusionsAβ25~35(20 μmol/L) induces differentiated HT22 cells to establish the best model of AD cells.

【Key words】Aβ25~35；HT22 cells； AD cells model

通讯作者：石向群(1964-)，男，主任医师，博士后，主要从事脑血管病研究。

基金项目：国家自然科学基金(81303097)；甘肃省自然科学基金(1308RJZA304)

〔中图分类号〕R74

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0521-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.004