β-细辛醚对皮质酮诱导原代培养星形胶质细胞凋亡的干预作用

高志影　荣　华　刘得水　董海影　兴桂华　韩丽君　卢长方　赵春明　吴淑琴　张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



β-细辛醚对皮质酮诱导原代培养星形胶质细胞凋亡的干预作用

高志影荣华刘得水董海影兴桂华韩丽君卢长方赵春明吴淑琴张晓杰

(齐齐哈尔医学院，黑龙江齐齐哈尔161006)

〔摘要〕目的探讨石菖蒲有效成分β-细辛醚对皮质酮(CORT)诱导星形胶质细胞(AS)凋亡的干预作用。方法原代培养AS，经不同浓度β-细辛醚预处理后,加入CORT诱导AS损伤模型，采用MTT法检测AS的细胞活力，利用流式细胞术Annexin-V/PI法检测AS凋亡率，用实时定量RT-PCR技术检测Bax和Bcl-2表达水平。结果CORT处理后，CORT组较空白对照组细胞活力低，凋亡率显著增加，Bax表达上调，而Bcl-2表达下调(P<0.05)。与CORT组比较，β-细辛醚组细胞活力高，凋亡率低，Bax的表达下调，Bcl-2表达上调(P<0.05)。结论β-细辛醚对CORT诱导的CORT凋亡具有抑制作用，下调Bax表达和上调Bcl-2表达可能是其作用的机制之一。

〔关键词〕β-细辛醚；皮质酮；星形胶质细胞；凋亡

第一作者：高志影(1986-)，女，研究实习员，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

星形胶质细胞(AS)功能障碍可导致神经突触可塑性的体内平衡机制被破坏，最终导致神经系统功能障碍。石菖蒲属于醒脑开窍类中药，有效部位主要集中在挥发油〔1〕，其有效成分β-细辛醚具有明显的神经保护作用〔2,3〕。本实验利用皮质酮(CORT)诱导原代培养AS损伤模型，以β-细辛醚进行实验干预，进一步深入研究β-细辛醚的神经保护作用及可能机制，从而为β-细辛醚防治神经系统疾病提供有价值的实验依据。

1材料与仪器

1.1实验动物SPF级SD大鼠，购买于哈尔滨医科大学实验动物医学部，许可证编号：SCXK(黑)2013-0001。经雌雄合笼获得子代新生1～3 d SD乳鼠。

1.2药品试剂β-细辛醚(天津一方科技有限公司)，DMEM/F12培养基(Hyclone公司)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)；PrimeScript RT reagent(TaKaRa公司)；引物设计和合成(生工生物工程有限公司)。

1.3仪器FACS Calibur流式细胞仪(BD公司)；ABI7300荧光定量PCR仪(ABI公司)。

1.4方法

1.4.1AS的原代培养新生1～3 d SD乳鼠，消毒，断颈剥离海马，冷磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中剪碎，离心弃上清，消化15 min。加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，过滤，离心弃上清。重新加入培养基，置于37℃含5% CO2的培养箱内培养。第9天时，置于恒温摇床内振摇18 h，选取对数生长期细胞进行实验。

1.4.2分组及处理按照不同的处理分为空白对照组、CORT组、CORT+β-细辛醚组(36 μmol/L、72 μmol/L、144 μmol/L)。将纯化后的AS消化、离心后，接种，24 h后β-细辛醚组加入不同浓度的药物，培养箱内培养4 h后，空白对照组加入培养基，其他4组分别加入含10 μmol/L CORT的DMEM/F12培养基，继续培养，然后进行指标测定。

1.4.3MTT法检测AS存活率AS细胞悬液100 μl接种量2×104，给药组加入不同浓度、等体积的β-细辛醚和CORT，CORT组加入等体积含CORT的溶剂，空白对照组加入等体积溶剂，将培养板放至温箱培养至所需时间，加入MTT 溶液，继续培养4 h 后，离心弃上清，加入DMSO，测定光密度值，计算细胞存活率。β-细辛醚处理浓度及处理时间参见文献〔4〕进行设制。

1.4.4Annexin-V/PI法检测AS凋亡率检测时吸弃培养皿中培养液，PBS溶液洗涤培养皿贴壁细胞后，用无EDTA的0.25%胰酶进行消化制备单细胞悬液，2 000 r/min离心5 min收集。用PBS溶液洗涤细胞2次，收集细胞；加入500 μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC混匀后，加入5 μl PI，混匀；室温、避光、反应5～15 min；进行流式细胞仪的观察和检测。

1.4.5RT-PCR检测AS的Bcl-2和Bax mRNA表达采用TRIzol试剂提取总RNA，Nanodrop 2000分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 的含量、纯度和完整性。 按PrimeScriptTM RT试剂盒说明书操作，逆转录合成cDNA。反转录反应条件：42℃，15 min进行反转录反应；85℃，5 s进行反转录酶失活反应；4℃，进行下一步操作。在ABI7300荧光定量PCR仪上进行PCR反应，采用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒。分别扩增Bax、Bcl-2和GAPDH，每样本作2个复孔和3个无模板的阴性对照。通反应条件:第一步是预变性，95℃，30 s，1个循环。第二步是PCR反应，95℃，5 s；60℃，31 s，40个循环。反应结束后，使用Sequence Detection software version1.2.3软件(Applied Biosystems公司)分析PCR过程各检测样本的Ct(Threshold cycle)值。通过溶解解曲线判断PCR反应的特异性。

通过2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平〔5〕，ΔΔCt=(Ct目的基因-CtGAPDH)-(Ct对照组-CtGAPDH)。Bax引物：正义，5'-AGA CAC CTG AGC TGA CCT TGG AG-3'；反义，5'-GTT GAA GTT GCC ATC AGC AAA CA-3'。Bcl-2引物：正义，5'-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3'；反义，5'-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA-3'。GAPDH引物：正义，5'-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3'；反义5'-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3'。

1.5统计分析采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、SNK检验。

2结果

2.1β-细辛醚对AS活力的影响经浓度为10 μmol/L的皮质酮处理0~96 h，CORT组细胞活力在48 h后逐渐下降(P<0.05)；给予不同剂量的β-细辛醚处理后细胞活力较单纯CORT处理细胞活力高(P<0.05)，48~96 h内呈时效依赖关系，见图1。

与CORT组比较：1)P<0.05图1　β-细辛醚对AS活力的影响

2.2β-细辛醚对AS凋亡率的影响CORT组〔(30.88±4.17)%〕较空白对照组〔(7.54±1.78)%〕细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。在CORT处理AS前4 h给予不同剂量的β-细辛醚的药物组，细胞凋亡率〔CORT+β-细辛醚36、72、144 μmol/L组分别为(20.63±3.78)%、(16.43±4.01)%、(16.93±2.30)%〕，较CORT组显著降低(P<0.05)。

2.3β-细辛醚对AS的Bax和Bcl-2 mRNA表达影响CORT组AS的Bax 2-ΔΔCt(5.53±0.82)显著高于空白对照组(1.00±0.41)，CORT处理后AS的Bax mRNA表达升高；CORT组AS的Bcl-2 2-ΔΔCt(0.20±0.05)明显低于空白对照组(1.00±0.19)(P<0.05)；与CORT组相比，β-细辛醚各剂量组AS的Bax 2-ΔΔCt显著减少(CORT+β-细辛醚36、72、144 μmol/L组分别为4.04±0.63,2.95±0.52,2.68±0.47)(P<0.05)，表明Bax mRNA表达显著降低；β-细辛醚各剂量组AS的Bcl-2 2-ΔΔCt升高(CORT+β-细辛醚36、72、144 μmol/L组分别为0.73±0.15，0.66±0.12,0.63±0.10)(P<0.05)，表明Bcl-2 mRNA表达升高。

3讨论

AS在中枢神经系统中扮演着重要的角色，对神经元的结构和代谢具有重要的调节作用。AS与突触前和突触后神经元共同构成“三重突触”结构的概念，揭示了存在于神经元和AS之间信号转导方式具有高度的可塑性及双向性，AS功能异常是神经功能障碍的重要病理生理学机制之一〔6〕。

Bcl-2基因家族被认为是最重要凋亡相关基因，Bcl-2和Bax是其家族成员之一。他们的基因产物主要位于线粒体膜、核膜和内质网等处。Bcl-2能够阻止生物氧化过程中的电子传递体细胞色素C从线粒体释放到细胞质，从而抑制细胞凋亡；而Bax蛋白与Bcl-2蛋白可以形成异二聚体，从而抑制Bcl-2的抗凋亡作用〔7〕。因此认为Bax是极其重要的促细胞凋亡基因之一。研究表明，影响凋亡的关键因素取决于Bax/Bcl-2 两蛋白之间的比例关系，若两者比例失衡将诱导凋亡的发生〔8〕。

糖皮质激素(GC)是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类甾体激素，应激时释放以调节身体的稳态。然而，一旦GC代谢失调与认知功能障碍和情感障碍疾病密切相关，持续过度释放会导致大脑海马组织萎缩和抑制海马神经再生〔9〕。CORT是糖皮质激素的一种，以剂量依赖的方式抑制大鼠大脑皮层AS的增殖〔10〕。

石菖蒲属于醒脑开窍类中药，有效部位主要集中在挥发油，β-细辛醚是挥发油的主要成分，被认为是其药理作用的主要物质基础，并有明显的神经保护作用。近年来研究发现，β-细辛醚对β-淀粉样蛋白诱导的PC12 细胞凋亡〔4〕。本研究推测β-细辛醚可能通过抑制促进凋亡蛋白Bax表达和上调凋亡抑制蛋白Bcl-2表达，使其比值达到相对平衡，减少AS的凋亡，从而发挥神经保护作用。

4参考文献

1魏刚，方永奇，柯雪红，等．石菖蒲开窍醒神物质基础的药学系列研究〔J〕.中国中医药信息杂志，2005;12(8)：51-3．

2Dong H，Gao Z，Rong H，etal．Beta-asarone reverses chronic unpredictable mild stress-induced depression-like behavior and promotes hippocampal neurogenesis in rats〔J〕.Molecules,2014;19(5)：5634-49．

3高志影，张春，董海影，等．石菖蒲有效成分对抑郁模型大鼠海马神经元的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2014;4(34)：1000-2．

4Li C，Xing G，Dong M，etal.Beta-asarone protection against beta-amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells via JNK signaling and modulation of Bcl-2 family proteins〔J〕.Eur J Pharmacol,2010；635(1)：96-102.

5Adnan M，Morton G，Hadi S．Analysis of rpoS and bolA gene expression under various stress-induced environments in planktonic and biofilm phase using 2(-DeltaDeltaCT) method〔J〕.Mol Cell Biochem,2011;357 (1-2)：275-82．

6Alison J，Erik M．Astrocytes and synaptic plasticity〔J〕.Neuroscientist,2010;16(1)：40-50．

7Volkmann N，Marassi FM，Newmeyer DD，etal.The rheostat in the membrane:BCL-2 family proteins and apoptosis〔J〕.Cell Death Differ,2014;21(2)：206-15．

8Scarfo L，Ghia P．Reprogramming cell death:BCL2 family inhibition in hematological malignancies〔J〕.Immunol Lett,2013;155(1-2)：36-9．

9Mirescu C，Gould E．Stress and adult neurogenesis〔J〕.Hippocampus,2006;16(3)：233-8．

10Crossin KL，Tai MH，Krushel LA，etal.Glucocorticoid receptor pathways are involved in the inhibition of astrocyte proliferation〔J〕.Proc Nat Acad Sci U S A,1997;94(6)：2687-92．

〔2015-03-25修回〕

(编辑李相军)

通讯作者：张晓杰(1965-)，女，教授，博士生导师，博士，主要从事神经精神疾病的病理学研究。

基金项目：黑龙江省自然科学基金项目(H201354)

〔中图分类号〕R749.4

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0566-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.022