乳腺癌患者新辅助化学治疗后ERCC1基因表达情况研究

郑锐年，林顺欢，关 灵，林钦雄，刘 淳，卢志斌，吴少敏

（广东省东莞市人民医院，广东 东莞 523000）

乳腺癌患者新辅助化学治疗后ERCC1基因表达情况研究

郑锐年，林顺欢，关 灵，林钦雄，刘 淳，卢志斌，吴少敏

（广东省东莞市人民医院，广东 东莞 523000）

目的研究乳腺癌新辅助化学治疗（简称化疗）对核苷酸切除修复基因ERCC1表达的影响及临床意义。方法逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)检测正常健康志愿者活检组织（18例），常规手术切除的乳腺癌标本（28例）和术前曾接受新辅助化疗的乳腺癌标本（18例）中ERCC1基因的表达，分析其表达与乳腺癌临床病理特征的相关性以及乳腺癌新辅助化疗对其的影响。结果无化疗组患者的ERCC1基因表达水平显著低于正常组（P＜0．05）。无化疗组乳腺癌中ERCC1基因表达水平与患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、病理分型、组织学分级、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮因子受体－2(HER－2)均无明显相关性(P＞0．05)。新辅助化疗组ERCC1基因的表达水平明显高于无化疗组(P＜0．05)。结论与正常人相比，乳腺癌患者ERCC1基因表达水平显著下降(P＜0．05)，而ERCC1基因的表达水平与乳腺癌的临床病理特征无相关性，患者经过新辅助化疗后ERCC1基因的表达水平可出现上调，对乳腺癌患者实施化疗治疗具有参考意义。

ERCC1基因；乳腺癌；新辅助化疗

切除修复交叉互补基因 1(excision repair cross complementing gene 1，ERCC1）是人类细胞DNA损伤后核苷酸切除修复途径基因家族中重要的成员之一。ERCC1基因位于染色体19q13．2，长度15 kb，编码由297个氨基酸残基组成的蛋白质。ERCC1基因的表达产物可特异性连结5′端的核酸内切酶，具有损伤识别和切除5′端的双重作用。目前，大量研究证实ERCC1基因的低表达常伴随癌症发病率的增加。为了解ERCC1基因在健康人群、乳腺癌患者以及接受新辅助化学治疗（简称化疗）后的乳腺癌患者中的表达情况，笔者对新辅助化疗或无新辅助化疗的46例乳腺癌临床标本以及18例健康志愿者采用逆转录聚合酶链式反应(RT－PCR)法进行检测，并对ERCC1基因的临床意义进行初步探讨。

1 资料与方法

1．1 一般资料

选取2012年8月至2015年8月我院收治的46例乳腺癌患者，均知情同意并接受手术治疗。根据术前治疗情况将患者分为化疗组（n＝18）和无化疗组（n＝28）。化疗组患者中，年龄28～59岁，平均（40．5±10．2）岁；临床分期为Ⅱ期14例，Ⅲ期4例；淋巴结转移情况为伴有5例，不伴有13例；病理类型为非特殊型癌15例，特殊型癌3例；组织学分级为为Ⅰ级2例，Ⅱ级9例，Ⅲ级7例。无化疗组患者中，年龄28～67岁，平均（43．2± 10．1）岁；临床分期为Ⅰ期8例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例；淋巴结转移情况为伴有5例，不伴有23例；病理类型为非特殊型癌24例，特殊型癌4例；组织学分级为Ⅰ级6例，Ⅱ级12例，Ⅲ级10例。另选取在我院行健康体检的志愿者18例为正常组，年龄28～62岁，平均（41．5±11．5）岁。所有试验均经医院医学伦理委员会批准，均签署知情同意书。3组对象年龄、性别资料比较，差异均不显著（P＞0．05），具有可比性。

1．2 方法

1．2．1 治疗方法

化疗组患者曾接受的新辅助化疗方案包括：TE方案，多西他赛(TXT)75 mg／m2，第 1天，表阿霉素(EPI)75 mg／m2，第1天，21 d为1周期；TEC方案，TXT 75 mg／m2，第 1天，EPI 75 mg／m2，第 1天，环磷酰胺(CTX）500 mg／m2，第1天，21 d为1个周期；4EC－4T方案：EPI 75 mg／m2，第1天，CTX 500 mg／m2，第1天，TXT(多西他赛)75 mg／m2，第1天。任选一种上述方案，化疗2～8个疗程。

1．2．2 RT－PCR检测

3组患者均进行RT－PCR检测，采用总RNA提取试剂盒及RT－PCR试剂盒(深圳晶美生物公司)。

总RNA提取：取300 mg乳腺癌组织，在液氮预冷的研钵中放置研磨，用药匙收集放入15 mL的EP管，加入Trizol液，组织和Trizol液的比例为100 mg∶1 mL，充分混匀后静置5 min。运用氯仿－异丙醇法将总RNA提取出来，电泳可见3个条带，即28S，18S，5S。用紫外分光光度计对 RNA的纯度进行鉴定，对 A260nm／A280nm的比值进行测定，使其维持在1．8～2．0。

第一链cDNA合成：1 μg总RNA＋1 μL oligo(dT) 18引物，焦碳酸二乙酯(DEPC)水补到12 μL，70℃的温度下孵育5 min，冰上骤冷;顺序加入4 μL 5×buffer＋2 μL 10 mmol／L dNTP＋20 U Ribonuclease inhibitor，37℃放置，孵育 5 min，加 200 UM－MuLV，终体积为20 μL。42℃放置，孵育60 min，70℃放置，孵育10 min，冰上骤冷，cDNA保存在－20℃。

链扩增：PCR引物（上海生工公司合成，见表1），反应体系为50 μL去离子水＋5 μL 10×PCR缓冲液＋5 μL cDNA＋2 μL 25 mmol／L MgCl2＋1 μL 10 mmol／L dNTP＋2．5 U Taq酶＋25 pmol上游特异引物＋25 pmol下游特异引物，充分混匀，在较短的时间内离心，94℃预热5 min，进行30个循环的扩增：94℃、55℃、72℃、94℃分别变性30 s、退火30 s、延伸40 s、延伸5 min。

表1 PCR引物

电泳检测：用1．0%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳，将电泳电压稳定在500 V／m 1．0 h左右，用5 g／L溴化乙锭(EB)染色20 min，然后在紫外灯、凝胶成像系统、LabWorkS4图形分析处理系统分别观察、拍照成像、分析。

ERCC1 mRNA的相对表达量＝ERCC1扩增带灰度／内参β－actin扩增带灰度。

1．3 统计学处理

2 结果

结果见表2和表3。

3 讨论

20世纪70年代末以来，全球乳腺癌发病率一直呈上升趋势[1]。近年，我国乳腺癌发病率的增长速度也已高出高发国家1%～2%。2012年国家癌症中心、卫生部疾病预防控制局公布的2009年乳腺癌发病数据显示，全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率高居女性恶性肿瘤的首位，女性乳腺癌发病率（粗率）全国合计为42．55／10万，城市为51．91／10万，农村为23．12／10万，乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题[2]。自 20世纪 90年代，全球乳腺癌死亡率呈下降趋势；究其原因，一是乳腺癌筛查工作的开展，使早期病例的比例增加；二是乳腺癌综合治疗的开展，提高了疗效，乳腺癌已成为疗效最佳的实体肿瘤之一[3]。

表2 3组对象ERCC1基因表达水平比较（s）

表2 3组对象ERCC1基因表达水平比较（s）

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表3 无化疗组患者ERCC1基因的表达水平与临床病理特征的相关性（s）

表3 无化疗组患者ERCC1基因的表达水平与临床病理特征的相关性（s）

t／F值0．229 P值0．82肿块大小（cm）0．5860．56病理类型例数13 15 13 12 3 240．4340．67组织学分级＞40＜2 2～5＞5非特殊型癌特殊型癌Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级46 0．8200．45腋淋巴结0．3650．72 PR 0．4160．68 ER＋－＋－＋－0．5230．60 HER－2＋＋／＋＋＋－／＋12 10 5 23 14 14 18 10 9 19 ERCC1 mRNA 0．961±0．047 0．973±0．033 0．958±0．021 1．003±0．048 1．010±0．026 0．974±0．041 1．002±0．040 1．041±0．041 0．965±0．048 0．946±0．041 1．003±0．035 0．962±0．036 0．982±0．059 0．962±0．023 0．965±0．042 0．991±0．020 1．003±0．023 0．957±0．0290．8470．40

DNA的合成和修复异常与肿瘤的发生、多药耐药均有密切联系，其中核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)是导致铂类药物耐药的重要机制。NER通路由多种DNA修复酶组成，ERCC1基因是NER通路中的限速基因，其编码的ERCC1蛋白参与DNA损伤识别和DNA链的切割，在DNA修复过程中具有重要作用。目前，大量研究证实ERCC1基因的低表达常伴随癌症发病率的增加[4－6]。因此，ERCC1基因表达水平与肿瘤易感性、化疗药物疗效预测、临床预后等相关性的研究，是近期临床研究的热点。

目前，有关ERCC1基因在乳腺癌中表达的研究，大多关注蛋白质水平。一项国际研究[7]对504例早期乳腺癌患者标本行ERCC1免疫组化检测并分析，结果表明，ERCC1蛋白表达并不能反映乳腺癌手术的预后，但ERCC1过表达与ER阳性、较低T分期、淋巴结阴性和年龄超过50岁有关，与远处转移、生存率无关。

本研究结果表明，无化疗组患者与正常健康患者相比，ERCC1基因的表达水平显著降低，与之前相关研究结果一致[8]；28例无化疗组患者的ERCC1 mRNA相对表达水平与不同年龄、肿块大小、病理类型、组织学分级、腋淋巴结转移情况、ER表达、PR表达、HER－2表达等临床病理特征无相关，说明ERCC1蛋白或mRNA表达水平或许不是一个预后不良因素。但本研究样本量较少，其结论有待大数据的临床研究进一步证实。

此外，本研究结果还显示，18例接受新辅助化疗患者组织的ERCC1 mRNA相对表达水平显著高于无化疗组（P＜0．05），说明ERCC1基因的表达水平在乳腺癌新辅助化疗后可上调，有利于乳腺癌的治疗。

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[2]方琼英，吴 琼，张秀玲，等．乳腺癌的流行现状分析[J]．中国社会医学杂志，2012，29(5)：333－335．

[3]莫 淼，柳光宇，吕力琅，等．乳腺癌筛查研究进展[J]．肿瘤，2012，32(9)：748－754．

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[5]Peters GJ，Van Moorsel CJ，Lakerveld B，et al．Effects of gemcitabine on cis－platinum－DNA adduct formation and repair in a panel of gemcitabine and cisplatin－sensitive or resistant human ovarian cancer cell lines[J]．Int J Oncol，2006，28(1):237－244．

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[8]Adam Vilmar，Jens Benn Sörensen．Excision repair cross－complementation group 1(ERCC1)in platinum－based treatment of non－small cell lung cancer with special emphasis on carboplatin: A review of current literature[J]．Lung Cancer，2009，64(2): 131－139．

Expression of ERCC1 Gene in Breast Cancer after Neoadjuvant Chemotherapy

Zheng Ruinian，Lin Shunhuan，Guan Ling，Lin Qinxiong，Liu Chun，Lu Zhibin,Wu Shaomin
（Dongguan People′s Hospital，Dongguan，Guangdong，China 523000）

Objective To study the expression of ERCC1 gene in breast cancer after neoadjuvant chemotherapy．Methods The expression of ERCC1 gene was detected by RT－PCR in 28 breast cancer patients without neoadjuvant chemotherapy and in 18 breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy．The expression and clinicopathological features of breast cancer as well as the relevance of the impact of neoadjuvant chemotherapy on it were analyzed．Results No chemotherapy patients ERCC1 expression level was significantly lower than the normal group,the difference was statistically significant(P＜0．05)．The differences of ERCC1 gene expression levels of the non chemotherapy group between different ages,tumor sizes,histological types,histological grades,axillary lymph nodes,PR, ER,HER－2 were not significant(P＞0．05)．Neoadjuvant chemotherapy group ERCC1 gene expression levels were significantly higher than those without chemotherapy group,the difference was statistically significant(P＜0．05)．Conclusion Compared with the normal, ERCC1 gene expression levels were significantly decreased in patients with breast cancer(P＜0．05)and ERCC1 gene expression and Clinical pathological characteristics of breast cancer not associated,after neo－adjuvant chemotherapy in patients with raised the ERCC1 gene expression can occur,chemotherapy in the treatment of breast cancer patients have some reference value．

ERCC1 gene；breast neoplasms；neoadjuvant chemotherapy

R969．4；R979．1

A

1006－4931(2016)05－0024－03

郑锐年（1983－），男，在职博士研究生，主治医师，研究方向为肺癌靶向治疗、肝癌靶向治疗，（电子信箱）aweifrom＠163．com，2857311978＠qq．com。

2015－09－10)

广东省东莞市科技计划项目，项目编号：2015105101180。