何首乌提取物对鱼藤酮所致帕金森病线虫模型的神经保护作用

李玉娟，段昌令，李连达，，王丹巧

（1．中国中医科学院医学实验中心，北京 100700； 2．中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，北京 100090）

何首乌提取物对鱼藤酮所致帕金森病线虫模型的神经保护作用

李玉娟1，段昌令2，李连达1，2，王丹巧1

（1．中国中医科学院医学实验中心，北京 100700； 2．中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，北京 100090）

目的研究何首乌提取物对鱼藤酮所致帕金森病线虫模型的神经保护作用。方法设对照组、鱼藤酮组和用药组(0．5 g／L，1．0 g／L)，观察其对线虫多巴胺神经元树突、体内活性氧水平及生存率的影响。结果与对照组相比，0．5 g／L和1．0 g／L何首乌提取物对帕金森病模型多巴胺树突减少表型有明显的抑制，显著增加正常多巴胺神经元树突的线虫比例，活性氧水平明显低于鱼藤酮组，线虫存活率明显高于鱼藤酮组。结论何首乌提取物提高线虫生存率，对鱼藤酮致多巴胺树突减少表型有抑制作用，何首乌提取物对鱼藤酮所致帕金森病线虫模型有神经保护作用，其作用机制与抑制活性氧生成有关。

帕金森病；何首乌；神经毒素；神经保护；秀丽隐杆线虫

帕金森病(PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大神经退行性疾病，是黑质纹状体系统多巴胺(DA)神经功能受损所致多巴胺与乙酰胆碱平衡失调的慢性疾病，以运动迟缓、静止性震颤和强直为主要特征[1]。其病因至今未明，可能与年老、环境因素及遗传因素有关，发病机制也涉及自由基、氧化应激、谷氨酸兴奋性毒性、线粒体复合物Ⅰ缺失、炎症、神经营养因子缺乏和凋亡等，在级联生化反应中这些机制相互作用最终导致神经元死亡[2]。

鱼藤酮来源于植物，是线粒体氧化磷酸化的解偶联剂，可特异性抑制呼吸链中的复合物Ⅰ。鱼藤酮能够引起黑质致密部多巴胺能神经元的变性、线粒体功能障碍和氧化应激反应，最终导致与PD相似的临床和病理学特征，广泛应用于PD发病机制以及药效评价的研究。

与哺乳类动物相比，线虫具有众多优点。成年雌雄同体线虫个体小（长约1 mm）、子代个体多（＞300个）、生命周期短（12 h内形成胚胎，经2．5～3．5 d发育成成年个体，寿命2～3周）、实验室中易培养，容易迅速大量获得。线虫解剖学简单，约有1 000个细胞，302个伪神经元细胞。线虫的神经系统包含许多在哺乳动物神经系统中已知的信号元件及信号传递系统。线虫中存在乙酰胆碱、谷氨酸、γ－氨基丁酸（GABA）、5－羟色胺（5－HT）、神经肽[3]及其他化学信号分子。线虫神经递质特异的转运体（膜及囊泡）及受体与哺乳动物对应的元件是高度保守的。研究发现，在线虫中不仅含有多巴胺，还包括其前体及代谢产物[4]，表明线虫多巴胺神经元与哺乳动物多巴胺神经元极为相似。线虫对于PD药物靶点的发现与确证及新的治疗药物研究具有重要贡献[5]。

何首乌是“十大南药”之一，植物来源为蓼科属(Polygonum)植物何首乌 Polygonum multiflorum Thunb．的干燥块根。近年来，有关其药理活性研究的报道较多，主要有以下几个方面[6－7]：调血脂及抗动脉粥样硬化等

国家自然科学基金项目，项目编号：81274121；中国中医科学院自主选题研究项目课题，项目编号：ZZ2015003。心血管系统作用；保护肝脏作用；抗氧化及抗衰老、增强机体免疫作用；改善记忆力、保护神经细胞和益智作用；抗菌作用；抗炎、镇痛作用。本研究中采用线虫PD模型，旨在探讨何首乌提取物对鱼藤酮所致PD线虫模型是否具有神经保护作用，为何首乌的临床应用提供参考。

1 资料与方法

1．1 材料与仪器

线虫品系：N2线虫由中科院生物物理所惠赠。转入α－synuclein突变基因（突变位点 A30P，＜Pdat－1:: alphasynuclein::Pcat－1:EYFP＞）的线虫PD模型（简称A30P线虫）及野生型(Pcat－1::EYFP)线虫[8]，由日本东京大学Tomoki Kuwahara博士惠赠。

药物和试剂：何首乌提取物(天津科曼斯特公司)；琼脂粉(日本协和株式会社)；蛋白胨（peptone，英国OXOID公司)；胰蛋白胨（tryptone，英国OXOID公司)；琼脂糖（agarose，西班牙Biowest公司)；胆固醇(北京奥博星生物技术有限公司)；蔗糖，二甲基亚砜（DMSO），鱼藤酮和DHR123为Sigma公司生产，其余试剂均为国产。

仪器：MIR－553型恒温培养箱（日本SANYO公司）；S6E型体视显微镜（德国 Leica公司）；XTS30－D型体视显微镜（北京泰克仪器有限公司）；Olympus BX51型荧光显微镜和Olympus CCD（DP71）型照相系统；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；MLS－3780高压灭菌锅（日本SANYO公司）。

1．2 方法

1．2．1 线虫常规培养[9]

将线虫接种于涂布E．Coli OP50的标准线虫培养基(NGM），于20℃恒温培养。

1．2．2 药物干预试验

同步化：用M9缓冲溶液将年轻成虫洗至无菌EP管中，加适量裂解液（0．5%次氯酸钠，0．5N氢氧化钠）裂解线虫，置低速离心机上离心（3 000 r／min，1 min），弃去上清液，再用M9液冲洗线虫2次，离心弃上清液后用移液枪吸取EP管底部线虫滴于NGM的无菌区，约48 h后裂解的线虫体内的受精卵基本发育成L4期幼虫，完成同步化用于下一步试验。

何首乌提取物干预对鱼藤酮诱导线虫PD模型多巴胺神经元树突的影响：同步化的线虫接种到各组培养基中，20℃恒温培养3 d，加入25 μmol／L鱼藤酮诱导线虫PD模型，同时加入不同质量浓度何首乌（0．5 g／L和1．0 g／L）干预，24 h后，M9液清洗线虫，挑取年轻成虫置荧光显微镜下观察，统计多巴胺神经元树突（部分）恢复线虫比例。独立重复3次。

何首乌提取物干预对鱼藤酮诱导线虫PD模型体内活性氧水平的影响：同步化的线虫接种到各组培养基中，20℃恒温培养3 d，加入25 μmol／L鱼藤酮诱导线虫PD模型，同时加入不同质量浓度何首乌（0．5 g／L和1．0 g／L）干预，24 h后，M9清洗线虫，加入终浓度为100 μmol／L DHR123在30℃下避光孵育，30 min后M9液清洗除去多余DHR123，上SYNERGY 2检测荧光度值（λex＝485 nm，λem＝520 nm）的变化。

何首乌提取物干预对鱼藤酮诱导线虫应激耐受力的影响：根据文献方法培养线虫，采用线虫生长培养基（NGM），喂饲E．Coli OP50，培养温度20℃。将L1期线虫与细菌的混悬液均匀加入到24孔培养板中，使每孔细菌浓度在 OD600的吸收值为2，平均每孔含20～30个线虫。待线虫长至L4期，分为对照组、鱼藤酮组和用药组（0．5 g／L和1．0 g／L），20℃培养24 h，光镜下观察线虫存活率[10]。用铂丝触碰不动者即视为死亡。

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 鱼藤酮诱导PD线虫模型镜下观察法的建立

图1显示，对照组CEP多巴胺神经元树突完整，而给予不同浓度鱼藤酮（25 μmol／L，50 μmol／L）会导致CEP多巴胺神经元树突出现不同程度的损伤，出现断点或缺失。

2．2 何首乌提取物对模型多巴胺神经元树突的影响

由图2可见，鱼藤酮诱导导致CEP多巴胺神经元树突缺失表型线虫的存在比例明显低于对照组（P＜0．001），而0．5 g／L和1．0 g／L何首乌提取物可以明显抑制多巴胺神经元树突的损伤，并增加鱼藤酮导致CEP多巴胺神经元树突缺失表型线虫的存在比例（P＜0．05）。

2．3 何首乌提取物对模型活性氧(ROS)的影响

由图3可见，25 μmol／L鱼藤酮可明显增高线虫体内活性氧的水平（P＜0．01），而给予0．5 g／L和1．0 g／L何首乌提取物干预24 h后，线虫体内活性氧水平明显低于鱼藤酮组（P＜0．05，P＜0．01）。

2．4 何首乌提取物对模型应激耐受力的影响

由图4可见，鱼藤酮所致N2线虫存活率明显降低（P＜0．001），而给予0．5 g／L和1．0 g／L何首乌提取物干预24 h后线虫存活率显著高于鱼藤酮对照组（P＜0．001，P＜0．001）。

图1 鱼藤酮处理24 h N2线虫CEP多巴胺神经元荧光显微镜图像（×100）

3 讨论

PD的主要病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元的进行性变性死亡、残存神经元多巴胺合成能力降低，导致纹状体多巴胺神经递质的不足，从而对锥体外系的运动调节功能失调。试验表明，当多巴胺能神经元减少60% ～80% 时，多巴胺含量降至正常值的30%，可导致PD的症状出现。

鱼藤酮PD模型可以模拟PD发病的许多特征，且鱼藤酮模型因为可以模拟路易氏小体的出现，而优于其他类型的PD模型。鱼藤酮来源于自然环境，其慢性暴露的制作方式能较好地模拟PD发病过程，在病理、生化、发病机制、行为改变等方面均能较好地模拟人类PD的相关特征[11]。

线虫具有精确的解剖结构、快速的复制周期、简短的生活史以及半透明的胞体，线虫的多巴胺神经元在细胞及分子水平上重点体现哺乳类多巴胺神经元的特点。但不同于脊椎动物含有上万个多巴胺神经元，雌雄同体的线虫仅有8个多巴胺神经元，易于观察。其中6个位于大前端，由两对CEP(cephalic)和一对ADE(anteriordeirid)神经元组成。通常选择CEP作为观察对象，并且通过转基因手段转入绿色荧光蛋白（GFP），可以在显微镜下进行观察，用于研究药物或遗传手段的干预作用[12]。

图2 何首乌提取物对鱼藤酮诱导24 h N2线虫CEP多巴胺神经元保护作用（×100）

图3 何首乌提取物对鱼藤酮诱导线虫帕金森病模型活性氧水平的影响

图4 何首乌提取物对鱼藤酮诱导的应激性损伤的保护作用

本研究结果显示，给予不同浓度（25 μmol／L，50 μmol／L）的鱼藤酮诱导线虫 24 h，可以看出线虫CEP多巴胺神经元树突出现断点或缺失，表明多巴胺神经元出现不同程度地损伤，50 μmol／L浓度组的损伤程度大于25 μmol／L，因此选择25 μmol／L作为后续研究使用的浓度，观察不同质量浓度何首乌提取物的保护作用。在给予高、低浓度何首乌提取物干预后可明显逆转这种表型存在的线虫比例，说明何首乌不但对鱼藤酮诱导的多巴胺神经元损伤具有一定的保护作用，且具有一定的促进损伤多巴胺神经元生长的作用。

鱼藤酮诱导24 h后，线虫体内活性氧大量增加（P＜0．01），然而给予何首乌提取物0．5 g／L，1．0 g／L干预后，线虫体内活性氧水平明显降低，说明抗氧化应激损伤是何首乌提取物保护机制之一。同时，何首乌提取物对鱼藤酮诱导的线虫死亡具有抗应激作用，低剂量组与高剂量组对鱼藤酮造模线虫生存时间存在显著性差异，提示何首乌提取物的神经保护作用具有一定的剂量依赖性。本研究结果表明，何首乌提取物对PD模型线虫的一些病理性损伤具有保护作用，其作用机制与抑制线虫体内活性氧水平升高有关。但何首乌提取物神经保护作用的具体作用机制还需要进一步的探讨。

综上所述，何首乌提取物对线虫PD模型的神经保护作用其机制与抑制线虫体内活性氧水平升高有关，并显著提高应激水平下线虫存活比例，延长线虫寿命，为何首乌的临床应用提供了参考。

[1]Farrer MJ．Genetics of Parkinson disease:paradigm shifts and future prospects[J]．Nat Rev Genet，2006，7(4):306－318．

[2]Teismann P，Schulz JB．Celluar pathology of Parkinsoncs disease: astrocytes，microglia and inflammation[J]．Cell Tissue Res，2004，318(1):149－161．

[3]Bargmann CI．Neurobiology of the Caenorhabditis elegans genome[J]．Science，1998，282(5 396):2 028－2 033．

[4]Wintle RF，Van Tol HH．Dopamine signaling in Caenorhabditis elegans－potential for parkinsonism research[J]．Parkinsonism Relat Disord，2001，7(3):177－183．

[5]李玉娟，王丹巧．线粒体功能障碍与帕金森病关系的研究进展[J]．中国药理与毒理学杂志，2013，27(4):727－730．

[6]佟海宁，刘丽君．何首乌的药理研究与临床应用[J]．亚太传统医药，2011，7(11):166－167．

[7]崔映宇，李焰焰．何首乌研究进展[J]．阜阳师范学院学报：自然科学版，2004，21(4):24－27．

[8]Kuwahara T，Koyama A，Gengyo－Ando K，et al．Familial Parkinson mutant alpha－synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans[J]．J Biol Chem，281(1): 334－340．

[9]Brenner S．The genetics of Caenorhabditis elegans[J]．Genetics，1974，77:71－94．

[10]Wilson MA，Hale BS，Kalt W，et al．Blueberry polyphenols increase lifespan and thermotolerance in Caenorhabditis elegans[J]．Aging Cell，2006，5(1)：59－68．

[11]Betarbet R，Sherer TB，MacKenzie G，et al．Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson′s disease[J]．Nat Neurosci，2000，3:1 301－1 306．

[12]Nass R，Hall DH，Miller DM，et al．Neurotoxin－induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans[J]．Proc Natl Acad Sci U．S．A，2002，99(5):3 264－3 269．

Neuroprotective Effect of the Extract of P．multiflorum Thunb．in a Caenorhabditis elegans Model on Rotenone－Induced Parkinson′s Disease

Li Yujuan1,Duan Changling2,Li Lianda1,2,Wang Danqiao1
(1．Experimental Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing,China 100700; 2．China Academy of Chinese Medical Sciences,Xiyuan Hospital,Beijing,China 100090)

Objective To study the neuroprotective effect of polygonum extract on rotenone－induced Parkinson＇s disease model nematode．M ethods The experienment set control group,rotenone group and treatment group(0．5 g／L,1．0 g／L),and their effect on nematodes dopamine neurons dendrites,and oxygen levels influence survival in vivo activity were observed．Results Compared with the control group,the 0．5 g／L,1．0 g／L Polygonum extract on Parkinson disease model significantly inhibited dopamine phenotype of dendritic,showed a significant increase in dopamine neuron dendrites normal proportion of nematodes,the reactive oxygen species was significantly lower than the rotenone group,and the nematode survival rate was significantly higher than rotenone group．Conclusion Polygonum extract improves the nematode survival,inhibits rotenone－induced dopaminergic phenotype of dendritic．Polygonum extract has neuroprotective effects on rotenone－induced Parkinson＇s disease,and its mechanism of inhibition is related to active oxygen production．

Parkinson′s disease;P．multiflorum Thunb．;neurotoxins;neuroprotection;Caenorhabditis elegans

R285．5；R282．71

A

1006－4931(2016)05－0012－04

李玉娟（1974－），博士研究生，研究方向为帕金森病的中药干预及分子机制研究；王丹巧（1959－），研究员，研究方向为中药药理，本文通讯作者，（电话）010－64089530（电子信箱）dqwang96＠sohu．com。

20515－10－14)