鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

吴 斌，樊海平，王雪妹，黄小红，张新艳，叶小军，林志铿

(1.福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002；2.福建省水产技术推广总站，福建 福州 350002；3.福建农林大学，福建 福州 350002；4.厦门快诊生物科技有限公司，福建 厦门 361006)

鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立

吴 斌1，2，樊海平1*，王雪妹3，黄小红3，张新艳1，叶小军1，林志铿4

(1.福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002；2.福建省水产技术推广总站，福建 福州 350002；3.福建农林大学，福建 福州 350002；4.厦门快诊生物科技有限公司，福建 厦门 361006)

以灭活鳗弧菌(SMW5)全菌为抗原，应用杂交瘤技术，制备了鳗弧菌单克隆抗体3株，分别命名为1H9、1C12、6F8，细胞亚类分别为IgG2a、IgM、IgG2b，其中1H9腹水效价为1∶6.4×105。制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体，效价为1∶3.2×105。应用纳米胶体金颗粒标记单克隆抗体1H9并制备金标垫，抗鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体与羊抗鼠抗体作为捕获抗体包被硝酸纤维素膜，分别作为检测线T和质控线C,建立鳗弧菌的胶体金免疫层析快速检测方法。经过对试纸条的特异性和灵敏度测定，结果表明：试纸条与嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、副溶藻弧菌、迟缓爱德华氏菌，7种水产常见病原菌没有交叉反应，与鳗弧菌特异性反应，检测灵敏度为6.3×104cfu·mL-1，检测所需时间低于10 min。所制备的鳗弧菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高和适应基层生产推广应用等优点。

鳗弧菌；单克隆抗体；多克隆抗体；胶体金；免疫层析

鳗弧菌Vibrioanguillarum最早分离自欧洲鳗鲡Anguillaanguilla[1]，可导致多种海水养殖鱼类的出血性败血症[2]，如欧洲鳗鲡、牙鲆Paralichthysolivaceus、大菱鲆Scophthalmusmaximus、花鲈Lateolabraxmaculatus、鲈鱼Lateolabraxjaponicus、大黄鱼Larimichthyscrocea及凡纳滨对虾Litopenaeusvannamei等[3-9]。鳗弧菌病发病迅速、死亡率高和流行范围广，对水产养殖生产造成严重的经济损失[10]。

夏永娟[11]以鳗弧菌标准株为抗原，制备了8株能稳定分泌抗鳗弧菌单克隆抗体，其中2株特异性较强，并应用于鳗弧菌检测方法的建立；余俊红等[12]从患病花鲈体内分离到鳗弧菌W-1，制备兔抗血清，建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法，检测灵敏度为105个·mL-1，且具有较高的特异性，同时还建立检测鳗弧菌的间接荧光抗体快速检测技术[13]；邹玉霞[14]以大菱鲆出血症的致病菌-鳗弧菌SMP1为抗原制备兔抗血清，建立了在大菱鲆肝肾组织中检测SMP1的间接ELISA方法，肾脏的阳性检出率为87.7%,肝脏的阳性检出率为90%；边慧慧等[15]建立了抗鳗弧菌抗体效价双抗原夹心ELISA检测法，其灵敏度比凝集法高8～16倍。

病原菌胶体金免疫层析快速检测方法具有快速、准确、高通量、便捷、价廉等优点，本研究拟以制备的鳗弧菌单克隆抗体和兔多克隆抗体，研制鳗弧菌建立胶体金快速检测试纸条，为水生动物鳗弧菌病的现场检测提供快捷的手段。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

鳗弧菌V.anguillarum(SMW5、参考株、1H00003)、溶藻弧菌V.alginolyticus(Js60517NA1)、创伤弧菌V.vulnificus(FJ04-L1)、副溶血弧菌V.parahaemolyticus(ATCC17802)、哈维氏弧菌V.harveyi(03152)、河流弧菌V.fluvialis(参考株)、非0-1群霍乱弧菌V.chleraenon0-1diarrhea(96-2)、嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila(ML316、JS01-1)、温和气单胞菌A.sobria(Fp60325NA)、豚鼠气单胞菌A.caviae(AB40511NA1)、迟缓爱德华氏菌Edwardsiellatarda(AL60306NA1)、类志贺邻单胞Plesiomonsshigelloides(LCCi190625)和无乳链球菌Streptococcusagalactiae(070717LL)均由福建省淡水水产研究所水产动物病害防治研究室保藏。

1.2 主要试剂

普通营养琼脂培养基(NA培养基)购自北京陆桥有限公司；羊抗鼠HRP-IgG为武汉博士德生物有限公司产品；RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品；HT、8-氮鸟嘌呤、美洲胎牛血清、融合剂PET3500为美国Sima公司产品；单克隆抗体亚类试剂盒、氯金酸、牛血清白蛋白、DMSO购自厦门泰京生物技术有限公司；硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、吸水纸为美国millipore公司产品。

1.3 鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体的制备

以灭活鳗弧菌(SMW5)为抗原，免疫新西兰兔(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体，并按照文献[16]的方法检测多克隆抗体效价。

1.4 鳗弧菌(SMW5)McAb的制备

将灭活鳗弧菌(SMW5)菌液(1×108cfu·mL-1)以每只0.5 mL的剂量，腹腔注射法免疫Balb/C雌性小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，按文献[17]的方法制备鳗弧菌(SMW5)McAb。

1.5 单克隆抗体效价测定及IgG亚类鉴定

对建立的单克隆抗体杂交瘤细胞株上清液测定效价，并按文献[17]的方法制备单克隆抗体细胞株1H9的小鼠腹水；按照Sigma公司的单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对制备的单克隆抗体进行亚类分析。

1.6 交叉反应

鳗弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、河流弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、非0-1群霍乱弧菌、类志贺邻单胞、无乳链球菌的灭活菌抗原以1×108cfu·mL-1的浓度分别包被酶标板，PBS为阴性对照，间接ELISA法检测制备的McAb与这些常见病原菌株的交叉反应。

1.7 灵敏度的检测

灭活的鳗弧菌(SMW5)抗原以10倍梯度稀释，从1×109cfu·mL-1稀释至1×102cfu·mL-1，4℃过夜包被。一抗为待测单抗，PBS为阴性对照。间接ELISA法分析抗原最低检测量即为灵敏度。

1.8 胶体金制备

根据文献[18]的方法，制备胶体金颗粒。

1.9 金标抗体的制备

1.9.1 标记时的最佳pH选定 取100 mL胶体金液分别置于3个小烧杯内，用0.1 mol·L-1K2CO3溶液分别调制成不同pH(6.0、7.4、9.6)，每种pH的胶体金溶液各取10 mL，分别加0.07 mg标记抗体，标记后的样品应用质控品进行检测。

1.9.2 标记时最佳抗体浓度选定 按照文献[18]的方法，取不同量的标记单克隆抗体标记胶体金，标记好后喷涂在聚酯膜上，干燥后制成标记垫，并与合格的包有检测线和控制线的硝酸纤维膜(NC膜)组装成测试纸条，用质控品进行检测。

1.10 胶体金垫的制备

将金标抗体均匀喷涂于聚酯膜上，37℃过夜干燥。

1.11 硝酸纤维素膜制备

1.11.1 检测线抗体浓度的确定 将抗鳗弧菌兔多克隆抗体用pH7.4的 0.01 mol·L-1PBS(含1% tween-20)分别稀释成2、1.5、1.0、0.5 mg·mL-14个质量浓度梯度，12 000 r·min-1离心10 min去沉淀，以2 μL·cm-1蛋白量喷涂于NC膜上，封闭，干燥，制成试纸条与不同稀释倍数的待测菌液进行测试，以确定检测线的最适包被蛋白浓度。

1.11.2 质控线抗体浓度的确定 将抗鳗弧菌兔多克隆抗体按最适浓度喷涂于NC膜的检测线位置，同时将羊抗鼠二抗用pH7.4的 0.01 mol·L-1PBS(含1% tween-20)分别稀释成4.8、2.4、1.2、0.6 mg·mL-14个浓度梯度，12 000 r·min-1离心10 min去沉淀，以2 μL·cm-1蛋白量喷涂于NC膜质控线位置上，封闭，干燥，制成的试纸条与不同稀释倍数的待测菌液进行测试，以确定质控线的最适包被蛋白浓度。

1.12 试纸条组装

在底板上依次贴上样本垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜、吸水纸，最上面贴一层MAX线标贴膜。用切条机将组装好的样品切成规定宽度的试纸条，包装备用。

1.13 试纸条特异性及灵敏度测试

1.13.1 试剂条检测特异性 将3株鳗弧菌、7株其他水产重要病原菌培养16 h左右，用试纸条进行特异性分析检测，BSA为阴性对照。

1.13.2 试纸条检测灵敏度测试 待测细菌培养16 h左右，收集菌体，菌体浓度倍比稀释至约103cfu·mL-1，用试纸条对稀释样品进行灵敏度分析试验。

2 结果与分析

2.1 多克隆抗体的制备及效价检测

制备鳗弧菌(SMW5)兔多克隆抗体约50 mL，效价为1∶3.2×105，表明制备的鳗弧菌兔多克隆抗体效价高。

2.2 单克隆抗体的制备及上清液效价和亚型分析

制备鳗弧菌(SMW5)单克隆抗体3株，分别命名为1H9、1C12、6F8，上清的效价分别为1∶6400、1∶3200、1∶800；细胞系亚类鉴定分别为IgG2a、IgM、IgG2b，结果如表1。1H9制备小鼠腹水效价为1∶6.4×105。

表1 单克隆抗体上清液效价及亚类鉴定Table 1 Titers and subclasses of McAb supernatant

2.3 单克隆抗体交叉反应

单克隆抗体1H9、1C12和6F8均能与免疫抗原鳗弧菌(SMW5、参考株)呈现阳性反应，1C12与溶藻弧菌(Js60517NA1)、创伤弧菌(FJ04-L1)、嗜水气单胞菌(ML316)有非特异性反应；6F8与副溶血弧菌(ATCC17802)、哈维氏弧菌(03152)、非0-1群霍乱弧菌(96-2)有非特异性反应；1H9与溶藻弧菌(Js60517NA1)、创伤弧菌(FJ04-L1)、副溶血弧菌(ATCC17802)、哈维氏弧菌(03152)、河流弧菌(参考株)、嗜水气单胞菌 (ML316 、JS01-1)、温和气单胞菌(Fp60325NA)、非0-1群霍乱弧菌(96-2)、类志贺邻单胞(LCCi190625)、无乳链球菌(070717LL)，11株菌均无交叉反应，如表2所示，结果表明1H9特异性强。

2.4 灵敏度的检测

1H9、1C12、6F83株单克隆抗体的灵敏度如表3所示，分别为4×103、2×103、8×103cfu·mL-1。

表2 单克隆抗体特异性试验Table 2 Specificity test on McAbs

表3 单克隆抗体灵敏度Table 3 Sensitivity test on McAbs

2.5 最佳标记pH和最佳标记抗体质量浓度

不同pH值标记的金颗粒测试结果表明，pH 6.0的金标记颗粒离心后发现有细小的颗粒沉淀物；pH 9.6的胶体金蛋白结合不佳，效价低，显色浅，最低检出限检不出结果；而pH 7.4的胶体金液较好，既没有沉淀，最低检出量也很好。

取不同浓度的标记单克隆抗体1H9标记胶体金颗粒，检测结果表明：标记单抗1H9加入的量过高(8.0 mg·L-1)，不仅背景不清楚，发红，而且易出现假阳性；若质量浓度太低(6.0 mg·L-1)，显色慢、颜色浅，最低检出限差；以7.0 mg·L-1标记抗体浓度最佳，即100 mL胶体金液加0.70 mg标记单克隆抗体1H9，最低检出限好，背景清晰，未出现非特异反应。

2.6 NC膜检测线与质控线蛋白包被质量浓度

将质量浓度为1.5 mg·mL-1抗鳗弧菌兔多克隆抗体包被于NC膜上作为检测线，将质量浓度为1.2 mg·mL-1羊抗鼠二抗包被于NC膜上作为质控线，对待测菌液检测灵敏度高，检测线和质控线清晰，反应稳定。

2.7 试纸条的特异性分析

将组装后的试纸条检测副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌7株水产病原菌、BSA样本(阴性对照)，检测结果均为阴性反应，与3株鳗弧菌检测结果为阳性反应(表4、图1)，说明本试纸条对鳗弧菌检测特异性高。

表4 鳗弧菌胶体金试纸条交叉反应测试结果Table 4 Cross reactivity of colloidal gold test strip on 10 bacteria strains

2.8 试纸条的灵敏度检测

经测试，胶体金试纸条检测的灵敏度为6.3×104cfu·mL-1(表5、图2)，检测时间少于10 min。

表5 试纸条检测鳗弧菌(SMW5)灵敏度试验结果Table 5 Sensitivity of gold test strip on V. anguillarum (SMW5)

3 讨论与结论

3.1 鳗弧菌单克隆抗体的筛选

夏永娟[11]以鳗弧菌标准株为抗原，制备获得的2株抗鳗弧菌单抗1D7和3A3均不与其他检测弧菌交叉，能特异性地检测出鳗弧菌，该研究中，使用的抗原鳗弧菌和应用于交叉反应的细菌均为标准株。吴圆圆[19]和本研究均以水产病原鳗弧菌菌株为抗原制备单克隆抗体，单克隆抗体的特异性测试应用的菌株均为水产常见病原菌，为进一步研制水产病原菌金标试纸条的研制奠定基础。本研究筛选的3株单克隆抗体，1H9特异性好，仅与鳗弧菌呈阳性反应，与其他测试的水产病原菌均无交叉反应，但1C12与溶藻弧菌、创伤弧菌有非特异性的交叉反应，6F8与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、非0-1群霍乱弧菌有交叉反应，这2株单克隆抗体的抗原决定簇可能为部分弧菌所共有。交叉反应结果说明在以全菌为免疫原制备单克隆抗体时，在单克隆抗体细胞株筛选阶段就必须加强与其他水产病原菌进行交叉反应测试，有助于尽早获得特异性好的McAb。

3.2 鳗弧菌胶体金免疫层析检测方法建立

双抗夹心法是水产病原菌胶体金免疫层析快速检测试剂条研制中常用方法，其中病原菌的检测抗体来源主要包括2种不同抗原位点的单抗[18，20]；1种单抗和兔多克隆抗体组合[21-22]；甚至仅应用兔多克隆抗体[23-25]。本研究共筛选出3株鳗菌单克隆抗体，但是在单克隆抗体的交叉反应测试中，仅1H9特异性好，而1C12和6F8与部分常见的水产病原菌有非特异性反应，因此，为了确保研制的胶体金免疫层析快速检测试剂盒对鳗弧菌的特异性检测，选择制备兔多克隆抗体与1H9组合建立鳗弧菌的双抗夹心检测体系，即用1株病原菌单克隆抗体1H9和兔多克隆抗体组合，制备了鳗弧菌胶体金快速检测试纸条。

在检测灵敏度主面，Lyerly[26]分别用单、多克隆抗体检测艰难梭菌Clostridiumdifficile毒素A，认为使用多抗作为检测制剂，检测灵敏度更高。刘亦娟[24]研究结果也支持这种观点。针对迟缓爱德华氏菌，辛志明[18]应用单抗和多抗组合，而秦璞[25]仅应用兔多抗，研制出迟缓爱德华氏菌金标试纸条，两者检测灵敏度均为1.00×105cfu·mL-1；同样是建立鳗弧菌胶体金免疫层析检测方法，本研究利用单抗和多抗组合，检测灵敏度为6.3×104cfu·mL-1，而高圆圆[19]以制备的2株鳗弧菌单克隆抗体组合，检测灵敏度为1.00×105cfu·mL-1，均未显示出明显差别。因此，金标试纸条检测灵敏度的影响因素很多，病原特性、抗体质量、金标制备工艺、金标免疫层析快速检测系统的调制，甚至外界因素如样品的量和pH也影响结果。

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(责任编辑：林海清)

Rapid Detection of Monoclonal Antibody againstVibrioanguillarumby Using Conjugated Colloidal Gold

WU Bin1，2, FAN Hai-ping1*, WANG Xue-mei3， HUANG Xiao-hong3, ZHANG Xin-yan1, YE Xiao-jun1,LI Zhi-keng4

(1.FreshwaterFisheriesResearchInstituteofFujian,Fuzhou,Fujian350002,China；2.FujianProvincialFisheryTechnicalExtentionCenter,Fuzhou,Fujian350002,China；3.FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou,Fujian350002,China；4.FujianXiamenKuaizhenBiotechCO.,Ltd.,Xiamen,Fujian361006,china)

Vibrioanguillarum, strain SMW5, were inactivated by formaldehyde to be used as the antigen for immunizing Balb/c mice. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) againstV.anguillarumwere obtained and named as 1H9, 1C12, and 6F8 with the isotypes of IgG2a, IgM, and IgG2b, respectively. The titers of 1H9 in ascites of Balb/c mice were 1∶6.4×105. The polyclonal antibody was prepared againstV.anguillarum, with a titer of 1∶3.2×105. A rapid, accurate and easy gold immunochromatographic lateral flow assay methodology (GICA) was developed for detectingV.anguillarum. The monoclonal antibody, 1H9, was conjugated with colloidal gold as a signal generator on the conjugate pad. The polyclonal antibody was used as a capture antibody for the test line (T), and the goat anti-mouse IgG antibody as the capture antibody for the control line (C) on nitrocellose membrane. A GICA test strip was assembled with an absorbing pad, a conjugate pad, and a nitrocellose membrane sprayed with the capture antibody. The sensitivity of the GICA test strip towardsV.anguillarumwas high with a detection limit of 6.3×104cfu·mL-1. The specificity of the assay showed no cross-reaction with 7 other aquaculture pathogens, includingAeromonashydrophila,A.cavia,A.sobria,Edwardsiellatarda, andStreptococcusagalactiae. An accurate confirmation could be completed in 10 min for the assay. It appeared that the newly developed method using the GICA test strip was adequate forV.anguillarumdetection.

Vibrioanguillarum;monoclonal antibody;polyclonal antibody;colloidal gold;gold immunochromatography assay

2016-05-18初稿；2016-07-14修改稿

吴斌(1978-)，男，硕士，高级工程师，主要从事水产动物病害分子免疫学研究(E-mail：wubinfire@126.com) *通讯作者：樊海平(1967-)，男，硕士，研究员，主要从事水产动物病害研究(E-mail:fanhaiping16@163.com)

现代农业产业技术体系建设专项(CARS-46-35)；福建省产业技术开发项目[闽发改高技(2008-796)]

S 917

：A

：1008-0384(2016)11-1145-06

吴斌，樊海平，王雪妹，等.鳗弧菌单克隆抗体-胶体金检测方法的建立[J].福建农业学报，2016，31(11)：1145-1150.

WU B，FAN H-P，WANG X-M，et al.Rapid Detection of Monoclonal Antibody againstVibrioanguillarumby Using Conjugated Colloidal Gold[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1145-1150.