丝瓜总酚提取和测定方法的优化

朱海生，庄尹宏，刘建汀，王 彬，陈敏氡，张前荣，温庆放*，李大忠，薛珠政

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省蔬菜工程技术研究中心，福建 福州 350013)

丝瓜总酚提取和测定方法的优化

朱海生1,2,3，庄尹宏1,2,3，刘建汀1,2,3，王 彬1,2,3，陈敏氡1,2,3，张前荣1,2,3，温庆放1,2,3*，李大忠1,2,3，薛珠政1,2,3

(1.福建省农业科学院作物研究所，福建 福州 350013；2.福建省农业科学院蔬菜研究中心，福建 福州 350013； 3.福建省蔬菜工程技术研究中心，福建 福州 350013)

为建立简单、稳定的丝瓜总酚提取和测定体系，对丝瓜果肉总酚的超声波辅助提取和福林-酚比色测定方法进行优化。丝瓜果肉与80%乙醇在比例为1∶10、40℃下超声波提取30 min，总酚的提取效果较好。在测定波长750 nm、0.5 mol·L-1Na2CO3体积3 mL、0.5 mol·L-1福林-酚体积1.5 mL、反应温度30℃、反应时间60 min时，总酚含量与吸光度呈良好的线性关系:Y=0.6279X+ 0.0273(R2= 0.9947)，说明此方法能够简便、准确、快速的测定丝瓜总酚含量。

丝瓜；总酚；超声波；福林-酚

丝瓜Luffacylindrica原产东印度，主要分布于热带、亚热带的亚洲各地，有普通丝瓜LuffacylindricaRoem和有棱丝瓜LuffaacutangulaRoxb 2个栽培种，在我国南北均有栽培，是我国主要的瓜类蔬菜[1]。丝瓜营养丰富，且具有很好的医疗保健功能，随着人们对饮食营养保健的日益重视，丝瓜作为一种药食兼用的高温季节市场供应的蔬菜和保健蔬菜，其需求量不断增大，栽培面积日益扩大，蕴含着巨大的市场前景，但丝瓜果肉及汤汁出现褐变，大大降低了果蔬的贮藏加工性能，严重影响丝瓜产品的商品价值，造成巨大经济损失，因此成为丝瓜育种和采后的研究热点。

酚类物质是植物体内重要的次生代谢产物，主要存在于细胞液泡内[2-3]，是苹果[4]、梨[5]、荔枝[6]、莲藕[7]等果蔬酶促褐变的底物，导致品质下降，降低园艺产品经济效益[8-9]。本试验采用超声波辅助提取和福林-酚比色法研究丝瓜总酚的提取和测定方法，为今后丝瓜酶促褐变机理研究及丝瓜新品种选育奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验丝瓜品种 本试验供试丝瓜品种(系)‘黑12’由福建省农业科学院作物研究所蔬菜中心提供。用双蒸水进行清洗，晾干，快速削皮后分装于保鲜袋中，液氮速冻后置于-80℃冰箱中储存备用。

1.1.2 试验试剂 福林-酚购自美国Signa公司；甲醇(CH3OH)、丙酮(CH3COCH3)、乙醇(C2H6O)、碳酸钠(Na2CO3)、没食子酸(C7H605)等为国产分析纯(广通贸易化学试剂有限公司)。

没食子酸溶液配制：称取 0.11 g没食子酸，用双蒸水溶解定容至1 000.0 mL，得到浓度为 100 μg·mL-1的没食子酸标准溶液。

1.1.3 试验仪器 DK-8D电热恒温水槽(上海-恒科学仪器有限公司)、BILON-96超声波细胞粉碎机(成都比郎实验设备有限公司)、UV1000紫外可见分光光度计(天美科学仪器有限公司)、AR224CN电子分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司)、CR22N冷冻高速离心机(北京顺心万昌科技发展有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 超声辅助提取丝瓜总酚工艺优化

(1)不同提取剂的选择：精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，分别加入60%的乙醇、甲醇、丙酮，料液比1∶8，冰浴下研磨至匀浆，于40℃、300 W下超声辅助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(2)不同乙醇浓度的选择：精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比1∶8，冰浴下研磨至匀浆，于40℃、300 W下超声辅助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(3)不同液料比的选择

精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，加入80%乙醇，料液比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，冰浴下研磨至匀浆，于40℃、300 W下超声辅助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(4)不同超声时间的选择

精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至匀浆，超声时间分别为10、20、30、40、50、60 min，40℃、300 W下超声辅助提取，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(5)不同超声温度的选择：精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至匀浆，超声温度分别为25、40、60℃，300 W下超声辅助提取30 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

1.2.2 福林-酚比色法测定丝瓜总酚含量的优化

(1)测量波长的选择：移取没食子酸溶液(100 μg·mL-1)1 mL于25 mL试管中，加入5 mL的蒸馏水，再加入1 mL的福林-酚比色剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液2 mL，用双蒸水定容至25 mL，于室温下避光反应1 h后，在500～900 nm的波长范围内扫描。

(2)试剂体积的选择：①Na2CO3体积的确定：移取没食子酸溶液7份各1 mL，加5 mL蒸馏水，加入1 mL的福林-酚比色剂，混匀静置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，用双蒸水定容至25 mL，在室温下避光反应1 h后，待反应液显色后于750 nm波长处测定OD值，确定最大OD值所对应的Na2CO3体积；②福林-酚体积的确定：取没食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸馏水，再分别加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL福林-酚试剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液3 mL，加蒸馏水定容至25 mL，于室温下避光反应1 h后，待反应液显色后于750 nm波长处测定OD值，以确定福林-酚的体积。

(3)测定时间的选择：取没食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸馏水，加入1.5 mL福林-酚试剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液的3 mL，用双蒸馏水定容至25 mL，在室温下分别避光反应10、20、30、40、50、60、90、120 min后，于750 nm波长处测定OD值，确定最佳测定时间。

(4)测定温度的选择：取没食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸馏水，加入1.5 mL福林-酚试剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1Na2CO3溶液的3 mL，用双蒸馏水定容至25 mL，分别在10、20、30、40、50、60℃下避光反应1 h后，显色后于波长750 nm处测定吸光度值，确定适宜的反应温度。

(5)标准曲线的绘制：移取0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL的没食子酸标准液于25 mL试管中，加入5 mL的蒸馏水，再加入1.5 mL的福林-酚比色剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L-1的Na2CO3溶液3 mL，加蒸馏水定容至25 mL，在室温下避光反应1 h后。显色后在750 nm波长处测定OD值，以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

以上试验方法均重复3次。

1.3 数据处理与分析

运用Excel 2003进行数据整理和作图。

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取丝瓜总酚工艺优化

2.1.1 不同提取剂对丝瓜总酚提取效果的影响 由图1可知，提取剂不同，总酚的提取效果也不同。其中，乙醇的吸光值最高，丙酮次之，甲醇最小。提取液对总酚物质的显色反应较大，其吸光值也越大，说明丝瓜总酚提取效果越好；同时，考虑到甲醇和丙醇的毒性及价格均高于乙醇，因此，选择乙醇作为丝瓜果肉总酚的提取剂。

2.1.2 不同提取剂浓度对丝瓜总酚提取效果的影响 由图2可知，随着乙醇浓度的增大，丝瓜提取液的吸光度在50%～80%的浓度范围内呈上升趋势，在80%时其吸光值最高；而后随着乙醇浓度升高，其吸光值呈现下降趋势，下降幅度明显。提取剂浓度为80%时吸光值最高，说明丝瓜总酚的提取效果较好，因此，选择80%的乙醇为丝瓜果肉总酚提取剂浓度。

2.1.3 不同液料比对丝瓜总酚提取效果的影响 由图3 可知，总酚提取液随着液料比的变化而变化。当料液比为1∶10时，丝瓜的总酚提取液基本上达到饱和，而后随着料液比的升高而下降。当吸光值越高，说明总酚提取越完全。当液料比为1∶12总酚提取量呈现下降趋势，表明液料比为1∶10时，丝瓜总酚提取效果较为充分。

2.1.4 超声时间对丝瓜总酚提取效果的影响 由图4所示，随着超声波时间的增加，总酚的吸光值呈现先上升后下降的趋势，在30 min中达到峰值，之后逐渐呈下降趋势。表明超声时间在30 min时，丝瓜总酚提取效果较好。

2.1.5 超声温度对丝瓜总酚提取效果的影响 由图5所示，随着超声波温度的增加，总酚的吸光值升高，其吸光值在40℃时达到峰值，在60℃时吸光值下降。表明超声温度在40℃时，丝瓜总酚提取效果较好。

2.2 福林-酚比色法测定丝瓜总酚含量的优化

2.2.1 最佳波长的确定 将没食子酸标准溶液置于波长500～900 nm范围内进行扫描，没食子酸标准溶液在波长750 nm达到最大值。吸光值越大，没食子酸溶液反应越完全，因此，选用750 nm作为本次丝瓜总酚含量测定的最适吸收波长。

2.2.2 最佳试剂体积的确定 由图6可知，总酚物质的显色效果随着Na2CO3体积的增加越来越明显，Na2CO3体积为1～3 mL时，吸光度呈现上升趋势，其对总酚物质显色效果越来越好；当Na2CO3体积达到3 mL时，吸光度达到最大值，对总酚物质的显色效果最好；但 Na2CO3体积超过3 mL时，其OD值不再明显增加，基本保持稳定；说明Na2CO3体积不足会导致总酚物质显色不完全。当Na2CO3的最佳体积为3 mL时吸光度值最大，反应也最明显，因此，表明Na2CO3的最佳体积为3 mL。

由图7所示，随着福林-酚体积的增加，吸光值也相应增加，总酚物质的显色效果也越好。当福林-酚体积为1.5 mL时，吸光值达最大，反应最完全。当福林-酚体积过低(0.25 mL)或过高(2 mL)时，对显色反应均产生抑制作用，降低其吸光值。因此，确定最佳福林-酚体积为1.5 mL。

2.2.3 最佳反应时间的确定 由图8可知，随着反应时间的增加，总酚物质的吸光值也相应增加，在前10 min吸光度值最小，反应效果不显著；在60 min时吸光值达到最大，反应最完全，显色反应明显；在60 min之后吸光值呈现下降趋势，变化幅度较小，显色反应不明显。因此，最佳反应时间为60 min。

2.2.4 最佳反应温度的确定 由图9可知，总酚的显色反应受温度的影响。随着反应温度(10～60℃)的增加，其反应产物的吸光值呈增长趋势，其中在30℃时吸光值达到最大值，之后随着反应时间的延长，其吸光值呈下降的趋势。说明当超过一定温度时，总酚的稳定性较差，反应产物在高温下易被分解。因此，选择30℃作为本次丝瓜总酚测定的最佳温度。

2.2.5 标准曲线的建立 由图10所示，将测定结果进行线性回归，结果得出吸光度与没食子酸标准溶液之间的关系方程式为Y=0.6279X+0.0273，R2=0.994 7，相关系数为0.994 7，说明在1～6 μg·mL-1有较好的线性关系。

3 讨论与结论

本试验以‘黑12’丝瓜品种(系)为试材，利用超声波提取方法[10-11]，对丝瓜总酚提取的提取剂、乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度等影响因子进行优化，利用福林酚比色法[12-13]，对丝瓜总酚测定的测量波长、试剂体积、测定时间、 测定温度等影响因子进行优化，获得了总酚提取和测定的反应体系：(1)提取优化结果：乙醇浓度为80%，液料比1∶10，超声波温度40℃，超声时间30 min；(2)测定优化结果：测定波长750 nm，反应时间60 min，反应温度30℃，0.5 mol·L-1Na2CO3体积3 mL，0.5 mol·L-1福林-酚体积1.5 mL。总酚含量与吸光度呈良好的线性关系:Y=0.6279X+ 0.0273(R2= 0.994 7)。本研究建立的丝瓜总酚提取和测定方法具有稳定性好、精密度高、操作简便、省时、不受蛋白质的干扰等优点，为丝瓜中总酚含量的研究提供技术支持，为后期抗褐变丝瓜品种选育研究提供了理论依据。

超声波辅助提取总酚效果好，具有回收率高、损耗小等优势，已在果蔬总酚中广泛应用[14-20]。本试验以‘黑12’丝瓜果肉鲜果为试材，利用超声波辅助提取丝瓜总酚提取液，提取效果较好。由于总酚含有某些羟基类物质，可与蛋白质和多糖等物质结合，形成稳定的化合物，因此选择丙酮、甲醇、乙醇作为丝瓜总酚提取剂[21]。通过上述有机溶剂提取总酚效果来看，乙醇效果最佳，所以选用乙醇作为总酚提取剂。何志勇[22]通过对橄榄总酚的提取比较，因丙酮具有剧毒，故选择乙醇；同时乙醇提取工艺简单，成本低且提取率高，故选择乙醇作为提取溶剂。超声时间与温度是提取果蔬总酚过程中重要的影响因素，本试验得出丝瓜总酚最佳超声波时间与温度分别为30 min和40℃。若超声波时间过短或者温度过低，丝瓜总酚提取效果也低，时间过长或者温度过高，则会破坏丝瓜总酚物质。因此，超声提取丝瓜总酚温度和时间不宜过长。

目前，总酚含量的测定方法有多种，如纸层析、薄层层析、气液色谱、高效液相色谱、福林-酚法等多种方法。其中纸层析、薄层层析在分离效果、速度和准确定量方面存在缺陷; 气液色谱用于植物酚类物质的分离测定速度快、灵敏度高，但该法需要衍生化处理，前处理比较麻烦; 而高效液相色谱法比较昂贵, 不适于大量的定量分析[23]。福林-酚比色法反应原理为酚类化合物在碱性条件下可将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚含量呈正相关，结果精确稳定，且具有操作方便、所用试剂价格低廉、适用于批量检测等优点，在植物总酚含量测定中应用广泛。本试验利用福林-酚法进行丝瓜总酚含量的测定，探索出基层实验室简单、快速、准确测定丝瓜总酚的有效方法。在不同的研究文献[24-25]中，比色条件选择差异较大，且不同的提取和测定条件下其测定结果也有所不同；测定最佳波长在650～760 nm，反应温度为20～60℃，反应时间在30～120 min等比色条件范围。本试验的结果与相关果蔬的总酚研究结果相同或者相近，但其反应体系的变化均在总酚反应的合适范围内。如黄树苹等[26]通过福林-酚法测定丝瓜总酚的波长为770 nm，而本试验的最佳波长为750 nm。严娟等[27]利用福林-酚法对桃总酚进行测定，测定波长为765 nm。张立新等[28]研究认为，测定总酚的反应体系存在一定的差异，其原因可能与品种和产地有关，因为同一果蔬，若品种不同，或种植在不同地区，其化学成分也会存在较大的差异。

[1]罗少波，罗剑宁，郑晓明. 我国丝瓜育种研究进展与展望[J]. 广东农业科学，2006，(1)：15-17.

[2]弓志青，王文亮.果蔬采后酶促褐变机理及影响褐变的因素研究进展[J].中国食物与营养，2012，18(2)：30-33.

[3]范金波，蔡茜彤，郑立红，等.果蔬中多酚成分及其分析方法的研究进展[J].食品工业科技，2014，35(4)：374-379.

[4]赵光远，蔡照磊，钟明辉苹果的酶促褐变及其影响因素[J].食品与发酵科技，2009，45(2)：36-37.

[5]袁 江，张绍铃，曹玉芬，等.梨果实酚类物质与酶促褐变底物的研究[J].园艺学报，2011，38(1)：7-14.

[6]WANG J B，WANG X S， XU B Y, et al. Physiological changes during the process of pericarp browning in the postharvest litchi[J].农业科学与技术：英文版， 2010, 11(5):10-16.

[7]王向阳，姜丽佳，王忠英. 莲藕的酶促褐变及其贮藏中褐变的控制[J].农业工程学报，2009，25(4)：276-280.

[8]林河通，席玙芳，陈绍军.果实贮藏期间的酶促褐变[J].福州大学学报:自然科学版，2002，30(1): 696-703.

[9]张清安，范学辉.多酚类物质抗氧化活性评价方法研究进展[J].食品与发酵工业，2011，37(11)：169-172.

[10]王雅,马重华,郭涛,等.杏子果肉总酚超声波辅助提取工艺优化及抗氧化活性研究[J].食品与发酵工业,2011,12:193-197，203.

[11]房玉林,齐迪,郭志君,等.超声波辅助法提取石榴皮中总总酚工艺[J].食品科学,2012,(6):115-118.

[12]李巨秀,王柏玉.福林-酚比色法测定桑椹中总酚[J].食品科学,2009,(18):292-295.

[13]卜彦花,周娜娜,王春悦,等.福林酚试剂法和紫外分光光度法测定冬枣总酚含量的比较研究[J].中国农学通报,2012,(1):212-217.

[14]巨伟,杨彩凤,赵勇.低温胁迫下冬小麦叶片细胞膜透性与抗寒性的相关研究[J].安徽农业科学,2011,39(19):116-117.

[15]谭谊谈,曾凯芳.鲜切果蔬酶促褐变关键酶研究进展[J].食品科学,2011,32 (17): 376-379.

[16]张长勇,马锞,徐匆,等.荔枝采后腐败褐变机理及保鲜技术研究进展[J].热带作物学报,2013,(8):1603-1609.

[17]姜翠翠,周如金,关志强,等.鲜切淮山的褐变及品质调控技术初探[J].食品工业,2012,(10): 126-129.

[18]郁志芳,李宁,赵友兴,等.鲜切莲藕贮藏中的酚类物质变化及控制褐变的抑制剂组合筛选[J].南京农业大学学报,2003,(1):78-81.

[19]彭贵霞.山药块茎贮藏适温和鲜切山药褐变机理及其控制技术的研究[D].南京:南京农业大学,2002,(6):29-30.

[20]庞坤,胡文忠,姜爱丽,等.鲜切苹果贮藏期间生理生化变化的影响[J].食品与机械,2008,24 (1):50-51.

[21]林玉芳.福建橄榄Canariumalbum(Lour.)Raeusch.若干功能成分和品质相关指标的研究[D].福州：福建农林大学,2012.

[22]何志勇.橄榄酚类化合物的分离纯化和结构研究[D].无锡:江南大学,2006.

[23]刘清,李玉,姚惠源.Folin-Ciocalteu 比色法测定大麦提取液中总多酚的含量[J].食品科技,2007，(4):175-177.

[24]严守雷,王清章,彭光华.藕节中多酚含量的福林法测定[J].华中农业大学学报,2003,22(4):412-414.

[25]郭丽萍,朱英莲.香蕉皮中多酚物质的提取[J].食品与药品,2008,10 (11):32-34.

[26]黄树苹,谈太明,徐长城,等.丝瓜多酚氧化酶的酶学特性初步研究[J].中国蔬菜,2009，(10): 17-22.

[27]严娟,蔡志翔,张斌斌,等.桃果肉总酚提取和测定方法的研究[J].江苏农业学报,2013,29(3):642-647.

[28]张立新,杭瑚,王宗花,等.某些常见蔬菜抗氧活性的研究[J].食品科学,1999，(11):21-23.

(责任编辑：柯文辉)

Extraction and Determination of Total Phenol in Luffa (LuffacylindricalRoem.)

ZHU Hai-sheng1,2,3,ZHUANG Yin-hong1,2,3, LIU Jian-ting1,2,3,WANG Bin1,2,3,CHEN Min-dong1,2,3, ZHANG Qian-rong1,2,3, WEN Qing-fang1,2,3*,LI Da-zhong1,2,3， XUE Zhu-zheng1,2,3

(1.CropsResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.VegetableResearchCenter,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 3.FujianEngineeringResearchCenterforVegetables,Fuzhou,Fujian350013,China)

To establish a simple and reliable extraction and measurement method for the total phenol content in luffa (LuffacylindricalRoem), ultrasound and Folin-Ciocaleu colorimetry were applied and operational procedures optimized. Phenols could be optimally extracted from the luffa mesocarp when it was mixed ultrasonically with 80% ethanol in 1∶10 ratio at 40 ℃ for 30 min. The total phenolic content had a linear correlation (Y=0.6279X+0.0273;R2= 0.9947) with the optical absorbance at 750 nm when the solution was made with 3 mL of 0.5 mol·L-1Na2CO3and 1.5 mL of 0.5 mol·L-1Folin-Ciocalteu to react with the sample for 60 min at 30℃. The newly developed extraction and subsequent measurement procedures were simple, rapid, sensitive and accurate. It was considered adequate for the determination of total phenol in luffa.

luffa; total phenol; ultrasound; folin-ciocalteu

2016-04-20初稿；2016-06-28修改稿

朱海生(1978-)，男，博士，副研究员，研究方向：蔬菜分子育种(E-mail：541585978@qq.com) *通讯作者：温庆放(1965-)，男,研究员，研究方向：蔬菜育种(E-mail：fjvrc@163.com)

福建省农业科学院科技创新团队PI项目(2016PI-40); 福建省自然科学基金项目(2015J01118);国家大宗蔬菜产业体系福州试验站(CARS-25-G-20)

S 642.4

：A

：1008-0384(2016)11-1204-06

朱海生，庄尹宏，刘建汀，等.丝瓜总酚提取和测定方法的优化[J].福建农业学报，2016，31(11)：1204-1209.

ZHU H-S，ZHUANG Y-H，LIU J-T，et al.Extraction and Determination of Total Phenol in Luffa (LuffacylindricalRoem.)[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1204-1209.