饲料中添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉营养的影响

姚清华，颜孙安，林 虬* ，郭清雄，苏德森

[1.农业部农产品质量安全风险评估实验室(福州)，福建 福州 350003；2.福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建 福州 350003；3.福建省水产饲料质量监督检验站，福建 福州 350003；4.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建 福州 350003；5.福建正源饲料有限公司, 福建 莆田 351111]

饲料中添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉营养的影响

姚清华1,2,3,4，颜孙安1,2,3,4，林 虬1,2,3,4*，郭清雄5，苏德森1,2,3,4

[1.农业部农产品质量安全风险评估实验室(福州)，福建 福州 350003；2.福建省精密仪器农业测试重点实验室，福建 福州 350003；3.福建省水产饲料质量监督检验站，福建 福州 350003；4.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，福建 福州 350003；5.福建正源饲料有限公司, 福建 莆田 351111]

在基础配合饲料中添加0.5%、1%、2%、4%抗菌脂肽，饲养瓦氏黄颡鱼8周，对其肌肉一般营养成分、氨基酸营养、脂肪酸营养进行分析比较。结果表明抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质、灰分含量无显著影响(P>0.05)。瓦氏黄颡鱼是氨基酸组成均衡性较好(EAAI>75、EAA/NEAA>79%)的优质水产品，富含Glu、Asp、Arg等有助于术后病人康复的氨基酸。Lys含量较为富余，适当摄入可平衡谷物中Lys短缺，第一限制性氨基酸为Met +Cys。4% 范围内添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼氨基酸组成无显著性影响(P>0.05)，EAAI随着AMI添加量增加逐渐降低，但仍高于75%。瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸主要组成种类不少于11种，其中饱和脂肪酸3种、单不饱和脂肪酸4种、多不饱和脂肪酸4种，不饱和脂肪酸相对含量均较高，富含多不饱和脂肪酸(二十碳四烯酸、EPA、DHA)。在4%添加范围内，抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成无明显影响。

抗菌脂肽；瓦氏黄颡鱼；氨基酸；脂肪酸

黄颡鱼Pelteobagrusvachelli，隶属于鲇形目、鲿科、黄颡鱼属，广布于中国东部各太平洋水系，是小型名优淡水鱼类，具有高蛋白、低脂肪的营养特点，味道鲜美、肉质细嫩、无肌间刺，深受消费者喜爱，具有较高的经济价值[1-4]。在日本、韩国、东南亚等国家具有巨大的市场，是出口创汇的优良品种之一。随着国内外需求量的增加，野生黄颡鱼产量远不能满足消费者的需求，故近年来黄颡鱼人工养殖规模不断扩大，是我国“十二五”期间优势农产品区域布局规划的重点品种之一，经济前景看好。

随着设施渔业的发展，水产养殖模式日趋集约化、工厂化，高密度养殖条件下水产病害频发，部分疾病甚至采用抗生素进行治疗，无疑增加了水产品安全的风险性。研发安全环保无残留的抗生素替代品成为研究热点之一。来自动、植物和微生物的抗菌肽因具有分子量小、水溶性好、热稳定性好、免疫原性小、无毒副作用、无残留且不易产生耐药性等优点。已有研究表明，含抗菌肽日粮能提高动物的生长性能、饲料利用率、提高免疫机能与抗病力[5-6]。

抗菌脂肽(antimicrobial lipopeptides, AMI)是由枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis天然发酵产生，与动物源抗菌肽相比，抗菌谱更广，对细菌、真菌、病毒、原虫、支原体和肿瘤均有抑制作用[6-7]。关于AMI在水产动物饲料中的应用研究尚不多见。本试验通过在配合饲料中添加AMI饲喂瓦氏黄颡鱼，研究AMI添加水平对瓦氏黄颡鱼肌肉营养的影响，为其作为新型抗生素替代品在水产动物配合饲料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 饲料原料与试验鱼 鱼粉、豆粕、抗菌脂肽等原料由福建正源饲料有限公司提供。瓦氏黄颡鱼购于福建省漳州龙海黄颡鱼养殖场。

1.1.2 主要试剂 石油醚、苯、甲醇、氢氧化钾、硫酸氢钠、无水硫酸钠、氯化钠(均为分析纯，天津市科密欧化学试剂发展有限公司)；37种脂肪酸甲酯标准品(目录号47 885-U，Supelco公司)；浓盐酸(优级纯，西陇化工)；混合氨基酸标准品(sigma-aldrich)、缓冲液、茚三酮溶液(GB/T 5009.124.2003)。

1.1.3 主要仪器设备 气相色谱仪(岛津GC-2010)、全自动氨基酸分析仪(日立L8800)、电子分析天平(METTLER TOLEDO AL204)、恒温干燥箱、水解管(用去离子水冲洗干净，烘干备用)。

1.2 方法

1.2.1 饲料配制 基础饲料根据DB 35/T 1054-2010 黄颡鱼配合饲料配制，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中添加 0(对照组)、0.5%、1%、2%和4% AMI(由福建正源饲料有限公司提供)所有饲料原料粉碎过40目筛，混合均匀后挤压成直径为3 mm的颗粒料，自然风干后置于自封袋中，-20℃冷冻保存。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrients in basal fishmeal (on air-dry basis)

1.2.2 养殖试验 养殖试验在福建正源饲料有限公司养殖基地进行，将黄颡鱼暂养2周后，将400尾健康无病、规格均匀、平均体重为(25±2)g的瓦氏黄颡鱼随机分为5个处理组(每个处理组4个重复，每个重复20尾鱼)，置于循环水养殖系统中，分别投喂相应的试验饲料。试验期间，水温控制在24～28℃，pH 7.8～8.0。日投饵量为鱼体重的3.0%～5.0%，每日分别于08：00和18:00投喂2次试验饲料，1 h后观察，用虹吸器吸底，清除残饵及死苗，称重记录。试验期为8周。

1.2.3 样品采集与一般营养成分测定 每组随机抽取黄颡鱼15尾，去头、内脏，取各部位肌肉，混匀。取适量样品，真空冷冻干燥后、称重，计算水分；将组织磨碎，根据GB/T 5009.6-2003 中索氏抽提法提取脂肪，抽提完成后，计算样品脂肪含量；抽提剩余的样品根据GB/T 5009.5-2010中凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.2.4 氨基酸组成测定 称取适量1.2.3抽提后剩余的样品，置于水解管中。参考GB/T 5009.124.2003，加入6 mol·L-1盐酸10 mL，抽真空，充入高纯氮气，再抽真空充氮气，重复3次，封口，110℃左右水解22 h，冷却。打开水解管，过滤，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内，用去离子水定容。取滤液1 mL于5 mL容量瓶内，用真空干燥器在40～50℃干燥，残留物用1～2 mL蒸馏水溶解，在干燥，反复2次，蒸干，溶解于1 mL pH2.2的缓冲液。用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样液的氨基酸含量。样品中色氨酸含量测定：取适量样品置于聚四氟乙烯衬管中，加入1.50 mL 4 mol·L-1LiOH溶液，于液氮中冷冻，将衬管插入水解玻璃管，抽真空，充入氮气，封管。110℃左右水解20 h，冷却，转移至25 mL容量瓶中，加入6 mol·L-1HCl中和，并用柠檬酸钠缓冲液定容。每个样品均做3组平行。

1.2.5 脂肪酸测定 取适量样品，加入4 mL 异辛烷，混匀，加入0.5 mL 2%氢氧化钾甲醇溶液，振荡1 min，皂化2 h，加正己烷(用氯化钠饱和)1 min，取上清液，备用。

岛津GC-2010气相色谱仪(配火焰离子化检测器)；HP88毛细管色谱柱：100 m×0.25 mm×0.2 μm；载气：氮气，恒流模式，流速：1.0 mL·min-1；分流进样1 uL，分流比：20∶1；进样口温度：250℃；程序升温：80℃保持1 min，以20℃·min-1速率升至175℃，再以4℃·min-1升至230℃，保持12 min。检测器温度：250℃；以标准样品的相对保留时间定性。用面积归一化法定量。

1.2.6 营养品质评价方法 氨基酸支/芳值(F)按以下公式计算：F=(异亮氨酸含量+亮氨酸含量+缬草氨酸含量)/(苯丙氨酸含量+酪氨酸含量+色氨酸含量+)

根据1973年WHO/FAO建议的每克氮氨基酸评分标准模式[8]和鸡蛋蛋白评分标准模式[9]分别按以下公式计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)[10-13]。

AAS=待测蛋白质中某一必需氨基酸含量(mg·g-1N)/Egg蛋白模式中相应必需氨基酸含量(mg·g-1N)

CS=待测蛋白质中某一必需氨基酸的相对含量(与必需氨基酸总量之比)/Egg蛋白模式中相应必需氨基酸的相对含量(与必需氨基酸总量之比)

式中：mg·g-1N为每g氮中氨基酸的mg数(肌肉氨基酸含量×62.5/肌肉蛋白质的百分含量)；p为待测蛋白；s为鸡蛋蛋白。

2 结果与分析

2.1 一般营养成分分析

与对照组比较，当饲料中添加0.5%、1%、2%和4% AMI时，瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质、灰分含量变化如图1所示。5组黄颡鱼肌肉蛋白质含量依次为(16.53±0.20)%、(16.47±0.22)%、(16.91±0.80)%、(16.87±0.41)%、(16.96±0.54)%；灰分含量分别为(1.25±0.21)%、(1.17±0.05)%、(1.16±0.04)%、(1.14±0.01)%、(1.18±0.04)%。SPSS 17.0 统计分析结果表明，饲料中添加AMI对瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质、灰分无显著性影响(P>0.05)。

2.2 AMI对瓦氏黄颡鱼肌肉氨基酸组成和营养的影响

在不考虑食物蛋白质消化率的条件下，食物的氨基酸组成和含量决定其蛋白质营养价值高低，蛋白质营养均衡的食物，不仅应含有种类齐全的人体必需氨基酸，且其组成模式应与人类比例相似[14]。AMI添加量对瓦氏黄颡鱼肌肉氨基酸组成和营养的影响如表2～4。瓦氏黄颡鱼至少含18种氨基酸，Glu含量最高，其次为Asp(部分含量可能由Asn酸水解时释放)，胱氨酸含量最低，与部分水产品的氨基酸组成特点类似[15-17]。Glu属鲜味氨基酸，在生物体内蛋白代谢过程中占重要地位，参与诸多化学反应。在临床上，Glu多用于治疗肝性昏迷和改善儿童智力发育[15-17]。Arg有助于纤维和胶原的增殖合成，可促进伤口愈合[15-17]。Asp可增强肝脏功能，消除疲劳[15-17]。可见，瓦氏黄颡鱼可作为部分术后患者的膳食，助于康复。瓦氏黄颡鱼肌肉呈味氨基酸约占氨基酸总量的45%，说明其味道鲜美度较高。

表2 抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉氨基酸含量及组成的影响(鲜重)Table 2 Effect of AML on amino acid contents in meat of P. vachelli [单位/(g·hg-1)]

表3 抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉中EAA含量的影响Table 3 Effect of AML on EAA content in meat of P. vachelli

表4 抗脂菌肽对瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质营养价值评分的影响Table 4 Effect of AML on nutritional value of meat protein of P. vachelli

瓦氏黄颡鱼肌肉EAAI值大于80%，必需氨基酸组成比较平衡，含量十分丰富，是营养价值较高的蛋白源。AAS和CS评分结果表明瓦氏黄颡鱼肌肉第一限制性氨基酸为Met +Cys； Lys含量远高于鸡蛋蛋白；可见，瓦氏黄颡鱼对于以谷物为主的膳食者来说，可弥补谷物中赖氨酸的不足，平衡膳食，提高人体对蛋白质的利用率；

统计结果表明，在4%范围内添加AMI对瓦氏黄颡鱼18种氨基酸含量、必需氨基酸总量、呈味氨基酸总量、氨基酸总量均无显著性影响(P>0.05)。EAAI随着AMI添加量增加逐渐降低，但仍高于75%。可见，AMI作为饲料添加剂不会破坏瓦氏黄颡鱼的蛋白质量及鲜美程度，但对其肌肉蛋白的氨基酸平衡性略有影响。

2.3 AMI对瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成和营养的影响

从表5可知，利用GC从瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪中分离出脂肪酸的组成种类至少有11种，其中饱和脂肪酸3种、单不饱和脂肪酸4种、多不饱和脂肪酸4种。5组瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成均较为接近，与普通肉类相比较，瓦氏黄颡鱼的不饱和脂肪酸相对含量明显比较高，与多数鱼类比较类似，具有保健功能。5组黄颡鱼肌肉单不饱和脂肪酸相对质量分数分别为49.1%、49.3%、49.3%、49.5%、49.3%，可见饲料中添加AMI对瓦氏黄颡鱼肌肉中单不饱和脂肪酸相对含量无影响，相对含量最高的单不饱和脂肪酸均为可有效降低血液总胆固醇和有害胆固醇的油酸相对质量分数最高(39.9%、40.6%、40.0%、40.4%、40.1%)。二十碳烯酸相对质量分数最低(1.9%、1.8%、2.2%、2.1%、2.2%)。5组黄颡鱼肌肉多不饱和脂肪酸相对质量分数分别为24.5%、24.2%、24.6%、24.5%、24.7%，主要种类有4种，其中亚油酸相对含量最高(17.0%、16.9%、17.0%、16.9%、17.0%)，二十二碳六烯酸(DHA)次之，其次为二十碳五烯酸(EPA)、亚麻酸。单不饱和脂肪酸含量高的食品能有效降低低密度脂蛋白和冠状心脏病发生[18]。其中油酸属于动物体内无法合成又是维持正常生长发育所必需的脂肪酸[18]。多不饱和脂肪酸尤其是EPA、DHA、花生四烯酸均有促进脑生长发育、改善脑机能、预防脑组织衰老，调节血脂和血糖，抑制血小板聚集，减少血栓形成，预防心血管疾病的作用[18]。5组瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪中不饱和脂肪酸含量远远大于饱和脂肪酸，与多种名优特水产动物类似[19-20]。综合分析结果可见，AMI对瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成无明显影响。

表5 抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成的影响Table 5 Effect of AML on fatty acid contents in meat of P.vachelli (单位/%)

3 讨论与结论

在饲料中添加抗菌脂肽不仅能够有效提高动物的生产性能、饲料利用率、改善肠道微生态环境、提高免疫机能与抗病力，且能改善动物产品品质。吕尊周[21]在日粮添加200 mg·kg-1抗菌肽粗提物能显著提高蛋鸡的蛋黄相对重。徐名能[22]的研究表明，在奶牛日粮中添加抗菌肽制剂可显著提高乳脂率但对乳蛋白率无显著性影响。郭丽君[23]的研究表明，抗菌肽对芦花鸡胸肌肉质性状、游离氨基酸及微量元素有一定影响。本试验中，投喂AMI添加量在4%水平内的膨化配合饲料，瓦氏黄颡鱼肌肉氨基酸组成有一定变化，但各组间均无显著性差异。随着抗菌脂肽添加量增加，瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白EAAI逐步降低；呈味氨基酸苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、赖氨酸总量呈先升后降趋势。分析认为抗菌脂肽可能通过某种途径影响瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质的合成和代谢，但机理尚不明确。

脂肪含量与肌肉肌束间的摩擦力密切相关，进而影响肌肉的嫩度，且肌肉的风味、营养与脂肪酸组成也有密切关系[24-26]。脂类具有重要的生物功能，是生物体重要能源和结构物质，在生物体内具有重要的生物学作用和生理调控功能[27-28]。与普通肉类相比较，瓦氏黄颡鱼的不饱和脂肪酸相对含量明显比较高，与多数鱼类比较类似。不饱和脂肪酸极易氧化，影响肉品的货架期，但对于烹调后的风味、硬度、黏结性密切相关，且具有保健功能。研究表明，水产动物肌肉脂肪酸组成除物种差异性外，尚与生活习性、季节、食性尤其是饲料(饵料)等密切相关。分析认为食物源是引起水生动物脂肪酸差异的重要因素之一，抗菌肽可能影响瓦氏黄颡鱼肠道形态和营养物质的吸收，进而影响肌肉中脂肪酸的组成，但影响机制仍不明确。

瓦氏黄颡鱼氨基酸组成均衡性较好(EAAI>75, (EAA/NEAA>79%)的优质水产品，富含Glu、Asp、Arg等有助于术后病人康复的氨基酸。Lys含量较为富余，适当摄入可平衡谷物中Lys短缺,第一限制性氨基酸为Met +Cys。4% 范围内添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼氨基酸组成无显著性影响(P>0.05)，EAAI随着AMI添加量增加逐渐降低，但仍高于75%。瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸主要组成种类不少于11种，其中饱和脂肪酸3种、单不饱和脂肪酸4种、多不饱和脂肪酸4种，不饱和脂肪酸相对含量均较高，富含多不饱和脂肪酸(二十碳四烯酸、EPA、DHA)。在4%添加范围内，抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成无明显影响。

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(责任编辑：柯文辉)

Effect of Antimicrobial Lipopeptides in Fishmeal on Nutritional Composition of Meat from Darkbarbel Catfish (Pelteobagrusvachelli)

YAO Qing-hua1,2,3,4, YAN Sun-an1,2,3,4, LIN Qiu1,2,3,4*, GUO Qing-xiong5, SU De-sen1,2,3,4

(1.LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforAgro-products(Fuzhou),MinistryofAgriculture,Fuzhou,Fujian350003,China；2.FujianKeyLaboratoryofPrecisionMeasurementforAgriculture,Fuzhou,Fujian350003,China；3.FujianAquaticFeedQualityControlandInspectionStation,Fuzhou,Fujian350003,China；4.InstituteofQualityStandardsandTestingTechnology,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350003,China；5.FujianZhengyuanFeedCo.,Ltd.,Putian,Fujian351111,China)

Effect of antimicrobial lipopeptides (AML) in fishmeal on the nutritional composition of the meat from Darkbarbel catfish (Pelteobagrusvachelli) was studied. Five diets incorporated with 0, 0.5, 1, 2, and 4% of AML were used to feed randomly selected 4 groups of fish comprising 20 individuals each for 8 weeks. The amino acids and fatty acids in the fish muscles were analyzed. The results showed no significant differences in protein or ash contents among the fish fed with the varied amounts of AML (P>0.05). On the other hand, the fish meat was considered of high-quality protein according to FAO/WHO standards. The greatest amount of amino acid in the meat was Glu, followed by Asp and Arg. The rich content of Lys was ideal to supplement grains for human nutritional need. AML did not show any significant effect on the amino acid contents (P>0.05). The fish meat contained more than 11 kinds of fatty acids, including 3 saturated, 4 monounsaturated, and 3 polyunsaturated fatty acids. There was no significant differences on the fatty acid contents found in meat from the fish fed on diets with 5 different AML levels either.

antimicrobial lipopeptides;Pelteobagrusvachelli; amino acid; fatty acid

2016-06-10初稿；2016-07-28修改稿

姚清华(1985-)，男，硕士，助理研究员，研究方向：水生动物营养与质量安全 *通讯作者：林虬(1963-)，男，副研究员，研究方向：农产品营养与质量安全(E-mail:linqiu3163@163.com)

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1025-6)；福建省财政专项——福建省农业科学院科技创新团队建设项目(2014QB-9)；莆田市科技局创新项目(2015N3005)

S 963

：A

：1008-0384(2016)11-1151-07

姚清华，颜孙安，林虬，等.饲料中添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉营养的影响[J].福建农业学报，2016，31(11)：1151-1157.

YAO Q-H，YAN S-A，LIN Q，et al.Effect of Antimicrobial Lipopeptides in Fishmeal on Nutritional Composition of Meat from Darkbarbel Catfish (Pelteobagrusvachelli)[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(11)：1151-1157.