胶体金标记兔抗-维氏气单胞菌Lam B 多克隆抗体的制备与优化

黄凌远 鄢林霞 徐婧 俞雨阳 熊权鑫 钟振东

（成都里来科创生物科技有限公司，四川成都 610000）

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）隶属于弧菌科，气单胞菌属，是一类革兰氏阴性、兼性厌氧杆菌，是一种人、兽及水生动物共患的条件致病菌，常引起水生动物腐皮病、烂尾病、细菌性败血症等多种病症，具有发病快、死亡率高的特点，给水产养殖造成巨大的经济损失[1-2]。斑点叉尾鮰作为人工养殖鱼种，具有生长繁殖快，鱼肉品质鲜等优点，但由于养殖条件等原因，感染维氏气单胞菌发病死亡的案例逐渐增多[3]。目前常采用平板分离培养法和分子生物学的方法进行检测。但上述两种方法均存在检测时间过长、检测效率低下、对专业检测人员和检测仪器要求高等缺点，不利于在基层推广。因此，开发一种灵敏高、检测速度快、操作简便的维氏气单胞菌检测产品十分必要。

外膜蛋白（OMP）是革兰氏阴性菌外膜中的主要结构成分，也是维氏气单胞菌重要的黏附因子。该类蛋白不仅能增强病原菌黏附能力，还具有良好的免疫原性，在鱼类疫苗研究中经常作为候选蛋白[4]。Lam B 蛋白属于革兰氏阴性菌的外膜孔蛋白家族，即Maltoporin 蛋白，是由lamB 基因编码，其功能如同特定麦糖糊精和麦芽糖通过大肠杆菌外膜的通道，能特异性摄取小分子物质，参与麦芽糖的摄取，具有较好的免疫原性，可作为亚单位疫苗的候选抗原[5]。Yang 等报道了Lam B 蛋白对维氏气单胞菌TH0426 的毒力和粘附能力具有增强作用[6]。

胶体金一般指以氯金酸为原料，在还原剂的作用下形成的一种胶体颗粒，可以与蛋白质特异性结合，保留蛋白质生物学特性，是胶体金免疫层析检测技术的基础[7]。本研究拟采用柠檬酸三钠法制备胶体金，该方法成本低，操作快捷、方便，结果准确，已经用于临床与科研等领域[8]。本实验通过制备胶体金对原核表达的Lam B 蛋白制备的兔抗-Lam B 多克隆抗体进行胶体金标记，优化胶体金制备条件和金标耦联条件，以期制备高质量的胶体金-兔抗-Lam B 多克隆抗体，为后续开发维氏气单胞菌的胶体金检测试纸奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

兔抗-Lam B 多克隆抗体（成都里来科创生物实验室自制）；氯化金四水合物、柠檬酸三钠、碳酸钾均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 主要仪器

1530 酶标仪 [赛默飞世尔科技（中国）有限公司]、FA2004N 电子天平（上海菁海仪器有限公司）、Direct-Q 3 超纯水系统（德国默克密理博公司）、85-2A 磁力搅拌器（金坛市友联仪器研究所）等。

1.3 胶体金制备前处理

实验中使用的各种玻璃器具均应先用洗涤剂清洗，自来水洗净后置于酸性重铬酸钾溶液（100g 重铬酸钾，加入750mL 蒸馏水，250mL 浓硫酸）中浸泡。12h 后取出用蒸馏水冲洗3 次，接着用双蒸水冲洗3 次，用锡纸包住瓶口放进烘箱，烘干备用。

1.4 柠檬酸三钠最佳加入量的优化

取4 支干净的试管分为1～4 组，分别加入1%柠檬酸三钠（75、100、150、200μL）与0.01%氯化金四水合物10mL，作为试验组。另取1 支干净试管不加柠檬酸三钠，仅加入10mL 0.01%的氯化金四水合物作为空白对照组。试验组和对照组均加入超纯水补齐至相同反应体积（10.2mL）。加热前，5 支试管混合液分别使用0.22μm 滤膜过滤至新的试管中，水浴加热至沸腾，观察试管中溶液颜色变化，待颜色保持不变后，继续加热10min，室温静置冷却，评价胶体金质量。评价标准：①肉眼观察胶体金稳定后的颜色；②使用酶标仪在可见光范围内（400～700nm）对4 组试验组胶体金进行波长扫描，获得胶体金可见光吸光谱，确定最大吸收波长。根据公式：y=0.4271x+514.56 计算胶体金粒径[9]。式中，y 为最大吸收波长（nm），x为胶体金粒径（nm），结合波长、粒径筛选出最佳柠檬酸三钠的加入量。

1.5 兔抗-Lam B 多克隆抗体的抗体标记浓度和pH 优化

在96 孔酶标板中分别加入200μL 胶体金，然后加入0.2mol/L K2CO3 调节pH 分别至6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，对应体积分别为4.5、7.5、8、10、16、19、23.5μL，随后加入浓度为1μg/μL 兔抗-LamB 多克隆抗体，加入体积分别为2、3、4、5、6、7μL，混匀，5min 后加入10% NaCl 溶液20μL，室温静置20min。使用酶标仪在520nm 读取吸光度，吸光度最大的孔即为最佳pH 和最佳抗体浓度组合。测量未标记胶体金和最佳抗体标记条件下的金标-兔抗-Lam B 多克隆抗体在400～700nm 的吸光谱，分析比较胶体金粒径分布。

2 结果

2.1 柠檬酸三钠最佳加入量

柠檬酸三钠与氯金酸的结合比例决定了胶体金的粒径，粒径大小会影响抗体与胶体金的结合程度，粒径过小时，胶体金颜色呈橙黄色，粒径过大时，颜色呈暗红色甚至黑色，当胶体金粒径为20nm 左右，最大吸收波长处于510～540nm 时，与抗体结合的效果最好，此时胶体金会呈现出酒红色[10]，本实验将10mL 0.01%氯化金四水合物加入1%柠檬酸三钠后，在加热过程中的液体颜色变化逐渐变成浅黄色、灰色、紫红色/酒红色，而未加入1%柠檬酸三钠的空白对照组颜色无变化。使用400～700nm 波长扫描各体系发现，组别3 试管中胶体金的颜色呈酒红色，最大吸收波长为524nm，吸光度值为0.6273（图1），换算胶体金粒径为22.10nm，最符合制备抗体胶体金的条件（表1），因此，后续试验选择10mL 胶体金加入体积为150μL 的1%柠檬酸三钠比例制备胶体金。

表1 柠檬酸三钠加入体积优化

图1 4 组柠檬酸三钠加入量制备的胶体金可见光扫描图谱

2.2 胶体金与兔抗-兔抗-Lam B 多克隆抗体结合的最佳浓度与pH

加入兔抗-Lam B 抗体的浓度为7μg，pH 为8.5 时，胶体金-兔抗-Lam B 在524nm 处的吸光度最大值为0.6439，与未标记胶体金最大吸光度（0.6493）相比无明显差异；比较分析两者在400～700nm 的吸收光谱后发现，两者波形、峰宽与峰高无明显变化（图2）。

图2 未标记胶体金与胶体金-兔抗-LamB 的可见光扫描图谱

3 结论与讨论

胶体金标记的抗体在食品、药品、临床检测上均得到广泛运用，由于胶体金标记颗粒属于纳米级技术，是决定胶体金结果的关键，因此，在制备过程中优化制备条件十分重要。本研究发现，在10mL 0.01%氯金酸中加入150μL 1%柠檬酸三钠制备而成的胶体金在524nm 处具有最大吸收峰，波峰窄，呈酒红色，粒径符合抗体胶体金的要求。

图3 不同兔抗-Lam B 抗体浓度与体系中pH 值对胶体金-兔抗-Lam B 吸光度的影响（524nm）

当胶体金中加入目的抗体后，胶体金对抗体蛋白具有吸附作用，此时抗体浓度与pH 会对胶体金吸附效果产生影响。当pH 低于蛋白质等电点时，抗体会形成聚合体，失去与胶体金的结合能力，此时需要加入K2CO3等碱性试剂调节pH[11]。本试验的目的抗体是兔抗-Lam B 抗体，优化发现抗体与胶体金最佳结合pH 为8.5，抗体浓度为7μg/μL，此时抗体胶体金在400～700nm 的波形未发生明显变化，峰宽与最大吸收波长未出现明显偏移，在524nm 处的吸光度与未标记胶体金无明显差异，说明胶体金粒径接近未标记的胶体金，标记前后变化不明显。

综上所述，本研究发现胶体金标记兔抗-维氏气单胞菌Lam B 多克隆抗体制备中柠檬酸三钠与氯化金四水合物的最佳比例为150μL:10mL，兔抗-Lam B 多克隆抗体的最佳浓度为7μg/μL，反应体系最佳pH 为8.5。