胶体金制备标记条件优化及其在农业中的应用

刘颖沙，何新全，李建科，刘颖楠，李冰花，王 迪

(1.杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西 杨凌712100； 2.汉中市勉县勉阳街道办事处，陕西 勉县724200； 3.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西 西安710119)

0 引言

胶体金标记技术目前越来越广泛地应用于免疫诊断等相关领域[1]。1971年，FAULK W P等[2]成功制备金标抗体(兔抗+胶体金)。BERGER E等[3]建立胶体金免疫层析法(GICA法)。胶体金免疫层析技术在临床医学、环境检测和农产品质量安全等领域有着广泛应用。本文围绕胶体金制备技术、标记技术进行优化，并探讨其在农业生产及农产品安全检测领域的应用。

1 胶体金制备技术优化

胶体金的制备方法，公认采用还原HAuCl4法[4]。氯金酸溶液在如柠檬酸三钠等类似相关还原剂的结合下，聚集为一定大小的颗粒物质，从而达到牢固状态。直径3～30 nm的胶体金可作为免疫标记探针，便于后续标记试验。

目前胶体金制备方法主要有柠檬酸三钠法、抗坏血酸法和柠檬酸三钠-鞣酸法。其中柠檬酸三钠法是制备胶体金的最佳方法，以0.01%氯金酸+2 mL 1%柠檬酸钠为最佳配比，以呈现酒红色为最佳颜色判定，以20 nm为最适标记粒径。但是此方法制备胶体金保存时间较短，为延长胶体金保存时间，可采取以下措施。

1.10.22 μm过滤操作

在胶体金的烧制过程，每一个步骤均将胶体金采用0.22 μm滤膜过滤[5]。未经0.22 μm滤膜过滤和经过0.22 μm滤膜过滤的胶体金溶液全波长扫描图和540 nm左右处放大图如图1～2所示。由图1可以看出，未过滤的胶体金溶液在540 nm附近出现突然上升趋势，随后下降等多处凸起趋势，曲线较粗糙，不够平滑，可能由于在此波长下胶体金颗粒大小不均 一或颜色不均匀造成。由图2可以看出，采用0.22μm滤膜过滤后胶体金溶液的全波长扫描曲线平稳光滑。因此，每一步处理液采用0.22 μm滤膜过滤可提高颗粒均一性和溶液稳定性。

1.2保存条件

制定胶体金溶液时，0.01%氯金酸溶液应在低温保存，制备时现用现配，在整个烧制过程中应严格确保玻璃器皿的洁净程度，制作完成后采用锡箔纸将溶剂瓶包起来避光保存，对比常规保存，此方法可适当延长胶体金的保存时间。

常规胶体金在保存过程中，不慎会有细菌生长或有凝集颗粒形成，采用4 000 g低温离心可去除凝集颗粒，分装保存过程中加入少许防腐剂(0.02%NaN3)可有利于延长保质期。

2 胶体金标记指标优化方式

2.1确定最佳pH值

若样品pH值为6和7时，加入10%NaCl后颜色变为淡蓝色或浅紫色，发生明显的聚沉现象，据此说明免疫胶体金较不稳定。pH值为8～10时的免疫胶体金颜色鲜艳，呈现酒红色，最接近本体颜色，说明在偏碱性的条件下免疫胶体金性状稳定，形成结合性好的金-多抗。综合考虑，一般以偏碱性条件，即8～10作为最佳标记pH值。

2.2确定最佳蛋白含量

1～9号管(1 mL胶体金)分别加入0～8 μL多克隆抗体(单克隆抗体)，低温混合0.5 h，添加100 μL 10%NaCl溶液，放置2 h，确定最佳含量。

若样品小于某个浓度时，产生蓝色、紫色现象，证明此时蛋白浓度较低，无法使胶体金完全饱和，从而NaCl溶液会使胶体金发生聚沉现象，此时的免疫胶体金不稳定。当达到某浓度，免疫胶体金颜色呈现酒红色，若继续加大浓度，始终保持酒红色到红色之间，最接近本体颜色，肉眼观察未有聚沉现象发生，据此，可以说明此浓度为合适蛋白量，一般选择合适蛋白量加1 mL的添加量为最佳蛋白含量，胶体金达到饱和稳定状态，形成金-多抗，性状最稳定。

2.3确定离心力

将标记条件pH值和蛋白量优化至最佳，按上述步骤将胶体金和多抗(单抗)结合，混合均匀，放入磁力搅拌器搅拌30 min(低温)，之后分别以5 000 rmin离心30 min、8 000 rmin离心25 min、10 000 rmin离心20 min和12 000 rmin离心15 min。测定光密度值OD520nm以及进行活性(效价)比较，确定最佳离心力。

一般选择活性最高对应的离心力为最佳离心力，若活性一致，以上清液OD值最低为标准，说明金标抗体沉淀较完全。

3 胶体金免疫层析技术优势

3.1检测所需时间短

用GICA法制备测试卡，可应用于检测领域[6]。检测所需时间为5～15 min，对比传统平板检测法需要4～5 d，ELISA法需要10 h，PCR技术需要24 h，可节约大量的检测时间。

3.2使用操作方便

胶体金速测卡使用只要3个步骤即可。打开密封包装的包装纸，取出速测卡；滴加样品；等待5～15 min，读数。操作简便，更易推广。

3.3成本低

经过初步计算，一条胶体金试纸条的成本仅仅为几元钱，对环境设备仪器要求不高。

3.4安全性好

制备过程中减少致癌试剂的使用，对人体无毒害性。

3.5灵敏度高和特异性强

胶体金免疫技术利用的原理是抗体与抗原的结构互补性，从而可提高特异性，此外在静电引力的作用下形成牢固状态，可提高检测灵敏度。

4 在农业中的应用

4.1植物检测

GICA法克服传统方法缺点，具有简便易行等优点，在检验植物病害领域得到充分应用。缪林玉[7]采用双抗体夹心模式，制备抗甜瓜细菌性叶枯病菌免疫层析试纸条。李鑫[8]成功建立ELISA和免疫层析技术法检测农产品(玉米、花生等)毒素。胶体金在植物病理、病菌检测方面，可以建立准确、快速、简便和经济的检测方法，可用于田间实时原地对各项病菌、毒素进行初筛和诊断。

4.2农药残留检测

农业是我国基础产业，农药种类日益增多，效果也日益增强。王宝芹[9]制备了2，4-D多克隆抗体，并针对性制备胶体金速测卡，试验结果在1～2 min就可显现，灵敏度可达到10.0 ngmL。施诚愿等[10]使用金标检测卡和配套检测仪对蔬菜进行农药残留快速检测，研究发现，多菌灵检测卡和啶虫脒检测卡符合蔬菜农药残留的快速检测需求。袁光宇等[11]开发了快速检测烟草中甲霜灵残留方法，研制了一种胶体金免疫层析检测试纸条。使用金标检测卡对果蔬进行农药残留快速检测，具有针对性强、操作方便和机动性强等特点，样品处理简单、检测时间短，能够实现快速、准确和批量检测。

4.3兽药残留检测

氟甲喹是动物专用抗生素，滥用或超标使用会造成兽药残留安全问题，对于食品安全和人体健康构成威胁。刘卫华等[12]研究了胶体金标免疫固相膜检测动物性食品中氟甲喹，适用于大量样品的快速定性筛查。盐酸克伦特罗被称为“瘦肉精”，国内每年均有因食用“瘦肉精”猪肉中毒的案例。化学检测存在杂质干扰、灵敏度低等缺点，仪器分析法费用高，步骤繁琐。王森等[13]制成一种瘦肉精三合一检测卡，用于检测3种物质(盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇)残留，此测试卡在大规模筛选领域尤为适用。兽药残留问题频发，导致食品安全问题日益突出，建立胶体金免疫分析方法，适用于大量样品的快速定性筛查，是一种简便、快速和低廉的兽药残留检测技术。

4.4非法添加物

汤轶伟等[14]采用胶体金偶联特异性三聚氰胺抗体，构建三聚氰胺免疫层析试纸条，此种方法不需任何处理可直接对牛奶样品进行检测，操作简便快捷，最低检出限为0.25 μgmL。赵福民等[15]搭建抗原包被体系和胶体金标记抗体体系，可同时检测那霉素、红霉素和林可霉素3种药物残留。在此研究领域，以非法添加物单克隆抗体研制为突破口，优化检测方法，建立胶体金免疫层析技术可靠，样品预处理方法简单，有些甚至不需要前处理，准确性高，适用于现场大批量样本的快速检测和筛选。

4.5食品微生物

大肠杆菌O157是一种高致病性的食源性致病菌，10个细菌就能致病。陈明慧[16]研发了适用于基层大肠杆菌O157：H7的胶体金免疫层析卡。王文彬[17]研究了乳制品中5种食源性致病菌，并建立沙门氏菌、李斯特菌等致病菌的胶体金免疫层析卡。速测卡检测在5～15 min就可完成，随身方便携带，不受场地限制，广泛应用于基层检验的初选领域。

在胶体金免疫层析法原理的基础上，刘颖沙等[18-19]制备金标抗体，改良传统结构，建立嗜酸耐热菌胶体金免疫层析法，制备嗜酸耐热菌速测卡，并评估其特异性及灵敏性，该速测卡与食品中其他常见致病菌没有交叉反应，具有较高特异性，检测灵敏度为107CFUmL。

除此之外，胶体金免疫层析技术也广泛应用于B族链球菌、甲肝病毒和食源性致病菌检测等领域。由于免疫层析技术具有简单、快速、灵敏度高及稳定性好等特点，可以控制食物源头及生产、加工过程中感染致病菌，减少食品安全隐患。

5 结束语

通过研究与探讨，采用0.22 μm过滤操作、锡箔纸包装和加入少许防腐剂可延长胶体金保存时间。通过确定最佳pH值、蛋白量和离心力可对胶体金进行抗体标记。胶体金免疫层析技术因其针对性强、操作方便、样品处理简单和检测时间短等特点，能够实现快速、准确和批量检测，已广泛应用于植物病虫害检验、农产品农药残留检测、兽药残留检测和微生物污染检测等农业生产与检测各个领域。