重组犬瘟热病毒F-H融合基因乳酸菌的构建及表达

苏凤艳，李哲，李艳芝，王春凤，曾范利

(1.吉林农业大学中药材学院 吉林 长春 130118；2.吉林省伊通满族自治县畜牧工作总站 吉林 伊通 130700；3.吉林省动物微生态制剂工程研究中心 吉林 长春 130118)

重组犬瘟热病毒F-H融合基因乳酸菌的构建及表达

苏凤艳1，李哲1，李艳芝2，王春凤3，曾范利1

(1.吉林农业大学中药材学院 吉林 长春 130118；2.吉林省伊通满族自治县畜牧工作总站 吉林 伊通 130700；3.吉林省动物微生态制剂工程研究中心 吉林 长春 130118)

为了构建重组犬瘟热病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌，采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术扩增CDV F-H融合基因。将F-H融合基因亚克隆至穿梭载体pSIP409多克隆位点上，构建pSIP-F-H表达重组子，并电转化至植物乳杆菌NC8感受态细胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting检测F-H融合蛋白的表达情况。结果表明，成功地扩增了CDV F-H融合基因，构建了pSIP-F-H重组表达质粒，并电转化至乳酸杆菌感受态细胞中。SDS-PAGE和Western blotting检测表明，重组乳酸杆菌表达了分子量约为62.96 ku的F-H融合蛋白，且该蛋白能与CDV阳性抗体反应，具有反应原性。

犬瘟热病毒；F-H融合基因；乳酸杆菌；表达

犬瘟热系由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的高度接触性传染病[1]。自1809年发现CD以来,该病已给经济动物养殖业、养犬业、野生动物保护业、动物园观赏业造成了巨大的损失[2]。且随着CDV的变异、动物对流行病因素的适应，CDV易感宿主的范围有扩大的趋势，流行趋势由散在发生趋势向群发趋势发展，临床症状也越来越复杂，其危害也越来越大，单纯依靠传统疫苗免疫不能彻底防制犬瘟热的流行与发生[3]，有必要研制新型的基因工程疫苗来防控疾病的暴发。

CDV由基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、血凝蛋白(H)、融合蛋白(F)和大蛋白(L)6种结构蛋白组成[4]，其中H和F两种糖蛋白组成病毒囊膜表面纤突，CDV通过H蛋白吸附到细胞表面的受体上，起细胞趋向作用，而F蛋白介导病毒与感染细胞、感染细胞与非感染细胞间融合，使病毒具有在宿主体内扩散的能力，是感染性病毒粒子进入宿主细胞所必需的，且可能介导病毒感染[5]。具有中和作用的抗H蛋白抗体和抑制细胞融合的抗F蛋白抗体，在抗CDV感染的机制中发挥重要作用，是机体的主要保护性抗原，是目前制备CDV亚单位疫苗或合成疫苗的首选抗原[6-7]。因此，本研究以穿梭载体pSIP409为工具，构建可表达CDV F-H基因的重组基因工程乳酸菌，为进一步研究基因重组乳酸杆菌的免疫效果及免疫保护作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体 大肠杆菌乳酸菌穿梭质粒载体pSIP409和植物乳杆菌NC8由印度卡马拉杰大学Anbazhagan.K高级研究员惠赠，吉林农业大学王春凤教授保存。菌株E.coliBL21和DH 5α由吉林农业大学经济动物实验室保存。pMD-18T-CDVF和pMD-18T-CDVH重组克隆质粒由本研究室构建。

1.2 工具酶和主要试剂 DNA Marker、EcoRⅠ、HandⅢ、T4 DNA连接酶、PCR试剂盒均为TaKaRa公司产品； DNA凝胶回收试剂盒为杭州维特洁生化技术有限公司产品；蛋白质分子量标准为上海生物化学研究所产品。兔抗犬瘟热阳性血清由中国农科院左家特产研究所惠赠；HRP标记的山羊抗兔IgG为北京鼎国生物技术有限公司产品。PVDF转移膜为Gleman公司产品。

1.3 引物的设计与合成 为了扩增CDV的F -H融合基因,共设计了2对4条引物。根据犬瘟热病毒F和H基因设计特异性引物P1和P2、P3和P4。引物 P1引入EcoRI 酶切位点，引物 P2引入一段由高亲水性氨基酸(Gly-Pro-Gly-Pro-Gly )编码基因GCCCGGACCCGGACC组成的linker；引物 P3引入与P2互补的linker，引物P4引入Hind Ⅲ酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

F-Linker上游引物P1: ATTAGAATTCCTTAGGTATTATACTGAGT

F-Linker下游引物P2：GCCCGGACCCGGACCAGAGCGCCTAACCGTCTGAA

Linker-H上游引物P3: GGTCCGGGTCCGGGCACACCTATGGATCATGTTGAG

Linker-H下游引物P4：CATTAAGCTTTTAACGGTTACATGAGA

1.4 犬瘟热病毒H基因、F基因和F-H融合基因的扩增与纯化 分别以克隆质粒pMD18T-CDVF和pMD18T-CDVH质粒为模板，PCR扩增用于构建乳酸菌表达载体的F和H基因片段。

F-Linker反应体系：模板1μL ，上游引物0.5 μL，下游引物0.5μL，2×Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，总体系25 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃热变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

Linker-H反应体系：模板1 μL ，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，总体系25 μL。反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃热变性30 s，58.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

F-H融合基因PCR反应体系：F-Linker回收产物0.4 μL，Linker-H回收产物0.6 μL，F-Linker上游引物P1 0.5 μL，Linker-H下游引物P4 0.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL，总体积25 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，对扩增产物采用DNA片段纯化试剂盒纯化。

1.5 克隆载体pMD18-F-H重组克隆质粒的构建 将纯化的F-H融合基因与pMD-18T Simple Vector进行连接，构建重组克隆质粒pMD18-F-H。并将重组质粒转化DH 5α，涂布于含Amp 的LB固体培养基中进行筛选，将阳性菌株用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行PCR和酶切重组质粒的鉴定。

1.6 乳酸菌表达载体pSIP-F-H的构建与鉴定 将重组克隆质粒pMD18-F-H和乳酸菌表达载体pSIP-409分别以EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，利用凝胶回收纯化试剂盒分别回收F-H基因和pSIP-409片段，以T4 DNA 连接酶于16 ℃连接过夜,次日转化至感受态细胞中。

挑取含em 200 mg/mL LB平板上8～12 h内生长的疑似阳性菌落,分别接种于含em的LB液体培养基中,37℃,180～200 rpm摇床过夜培养,提取质粒,进行PCR和双酶切鉴定。

1.7 植物乳杆菌NC8的电转化 取5 μL重组质粒pSIP-F-H加入200μL乳酸菌感受态细胞中,轻轻混匀,移入预冷的电击杯中冰上静止5min, 调节电转化仪电压为2.0 kV和6 ms,进行电击。电转化结束后,取出电击杯冰上静止5 min,将转化物移至800 μL的MRS液体培养基(含0.5 mol/L庶糖)中,30℃静止厌氧培养3 h。取150 μL菌液涂布于MRS固体培养基(含em 200 mg/mL),30℃静止厌养培养24-36 h。挑选生长良好的单菌落,接种于5 mL MRS液体培养基(含em 200 mg/mL)中,30℃静止厌氧培养过夜,乘胜小量质粒提取试剂盒提取乳酸菌质粒,并进行PCR和双酶切鉴定, 阳性质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.8 CDV F-H蛋白的表达检测

1.8.1 重组乳酸菌SDS-PAGE检测 将重组乳酸菌接种于MRS液体培养基(含em 200 mg/mL)中,30℃静止厌氧培养至OD600约等于0.3时,添加诱导肽SppIP进行诱导培养，于诱导前、诱导后3和6 h取菌液超声裂解进行SDS-PAGE检测。同法处理空载体pSIP-409乳酸菌培养作为对照。

1.8.2 重组乳酸菌的Western blot分析 经SDS-PAGE电泳后的表达产物电转移至PVDF膜后，取出PVDF膜置于封闭液中，37℃封闭1 h。封闭结束后，以洗涤缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次3 min。加入犬瘟热多克隆抗血清，37℃感作1 h，以洗涤缓冲液洗涤PVDF膜5次，每次3 min。加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，37℃感作1 h，以洗涤缓冲液洗涤PVDF膜5次，每次3 min。加入新配制的DAB显色液，37℃避光显色。

3 结果

3.1 F-Linker、 Linker-H 和F-H融合基因的扩增结果 以克隆质粒pMD18T-CDVF和pMD18T-CDVH质粒为模板，分别扩增得到了约860 bp的F-Linker基因(图1A)、约850 bp的Linker-H基因(图1B)、约1700 bp的F-H融合基因(图1C)，与预期扩增的基因大小一致。

3.2 重组克隆质粒pMD18-F-H的PCR 和酶切鉴定结果 以重组质粒pMD18-F-H为模板，进行PCR扩增，得到了约1700 bp的基因片段，与预期大小相符(图2)。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，得到了约2700 bp的pMD18-T线性片段和大小约为 1700 bp的目的片段，结果表明，该融合基因已经连接到克隆质粒 pMD-18T Simple vector 上(图2)。

M.DNA 标准 DL 2000(自上而下：2000,1000,750,500,250,100 bp)图1 F-Linker、Linker-H和F-H融合基因的扩增结果

M.DNA 标准 DL 2 000(自上而下：2000,1000,750,500,250,100 bp)1.pMD18-F-H EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定 2. pMD18-F-H PCR鉴定图2 重组克隆质粒的鉴定结果

3.3 重组乳酸菌表达质粒 pSIP-F-H和pSIP-IL-F-H的鉴定结果 以重组乳酸菌表达质粒 pSIP-F-H为模板，进行PCR扩增，得到了约1700 bp的基因片段(图3A)，与预期大小相符。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，得到了pSIP409线性片段和大小约为 1700 bp的目的片段(图3B)，初步表明，融合基因已经连接到乳酸菌表达载体pSIP409上。阳性重组乳酸菌表达质粒 pSIP-F-H送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，结果与水貂源CDV F-H基因序列比对结果完全一致，没有出现缺失、移位、错配及突变现象，证实成功地构建了重组乳酸菌表达质粒pSIP-F-H。

3.4 重组融合表达载体在大肠杆菌诱导表达结果 在E.coliBL21(DE3)中，重组表达质粒pSIP-F-H由SppIP诱导表达，经SDS-PAGE电泳分析显示，重组表达质粒在E.coliBL21 中出现表达产物，表达的融合蛋白大小约为62.96 ku(图4A),与预测大小相符。

为了进一步鉴定表达产物，将表达的蛋白质经SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，以犬瘟热多克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，联苯胺(DAB)为底物，进行western-blot分析，在62.96 ku(图4B)处分别有一条明显的蛋白印迹带，表明经大肠杆菌表达后，表达产物依然具有与CDV 抗血清结合的免疫反应性。3.5 重组融合表达载体在乳酸菌中诱导表达结果 重组表达质粒pSIP-F-H在乳酸菌NC8中经SppIP诱导后，经SDS-PAGE电泳分析显示，重组表达质粒在乳酸菌中出现表达产物，表达的融合蛋白约为62.96 ku(图5A),与预测大小相符。

M. 250bp DNA Ladder Marker(自下而上：250、500、750、1000、1500、2250、3000、4500 bp)1. pSIP-F-H PCR鉴定 2. pSIP-F-H EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定图3 重组乳酸菌表达质粒的鉴定

1. 蛋白质分子量标准(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4)；2，3. pSIP-F-H在大肠杆菌BL21中表达产物；4.空载体pSIP-409在大肠杆菌BL21中诱导前产物；5.空载体pSIP-409在大肠杆菌BL21中诱导后产物；6.蛋白质分子量标准(180、135、100、75、63、48、35、25、17)；7.pSIP-F-H在大肠杆菌BL21中表达产物图4 大肠杆菌表达产物的鉴定

为了进一步鉴定表达产物，表达的蛋白质经SDS-PAGE后，电转移至PVDF膜上，以犬瘟热多克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，联苯胺(DAB)为底物，进行western-blot分析，在62.96 ku(图5B)处有一条明显的蛋白印迹带，表明经乳酸杆菌表达后，表达产物依然具有与CDV 抗血清结合的免疫反应性。

1，2. pSIP-F-H在乳酸杆菌NC8中表达产物； 3.空载体pSIP-409在乳酸杆菌NC8中诱导前的产物；4. 蛋白质分子量标准(180、135、100、75、63、48、35、25、17)；5.空载体pSIP-409在乳酸杆菌NC8中诱导后的产物；6. 蛋白质分子量标准(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4) ；7. pSIP-F-H在乳酸杆菌NC8中表达产物 图6 乳酸杆菌表达产物的鉴定

4 讨论

随着毛皮动物养殖业的不断扩大，集约化、密集程度越来越高，犬瘟热成为严重威胁毛皮动物养殖业的疾病之一。尽管我国在毛皮动物犬瘟热的诊断和防制上也做了大量的卓有成效的工作，研制成功了犬瘟热弱毒疫苗和灭活苗，在全国范围内大面积推广，并取得了明显的经济效益。但是，在实际生产中，犬瘟热仍时有暴发[8-10]，尤其近几年来，国内许多地区频频出现免疫毛皮动物爆发犬瘟热的报道[11-12]。由于毛皮动物犬瘟热发病日趋严重，生产上迫切需要有效的防治技术，急需开展深入研究并研制高效的防制技术，有效控制犬瘟热的发生与流行。

乳酸菌作为机体胃肠道菌群中的益生菌，可调节胃肠道常菌群，保持胃肠道内微生态平衡，增强机体的免疫力，且菌体本身含有的多种成分亦有强大的益生功能[13]，不产生内毒素，菌体表达的外源蛋白不需要纯化即可与菌体一起服用，是目前较理想的转化或表达系统[14-15]。目前乳酸菌作为递呈肽类、低聚糖和核酸等生物分子载体的研究日益成熟，乳酸菌已成为运载功能分子的重要工具，在介导消化道局部免疫，进而影响全身免疫具有重要作用[16]。胡静涛等[17]构建了重组鹅源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸杆菌，SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明，构建的HN基因重组乳酸菌可表达与HN蛋白大小相符的条带，而且该表达蛋白可与NDV阳性抗体发生反应，具有反应原性。苏君鸿等[18]以乳酸杆菌为载体构建了猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗，具有益生性与免疫预防的双重功效。本研究以CDV的H基因和F基因为研究对象,采用SEQ-PCR技术扩增CDV的F-H融合基因，成功构建了CDV F-H基因的重组质粒pSIP-F-H，电击转入乳酸杆菌NC8中构建重组乳酸工程菌，SDS-PAGE和Western-blot分析结果证实，该重组菌能够表达CDV的F-H融合蛋白，且该表达蛋白可与CDV的多克隆抗体反应，具有免疫原性，这一研究结论与胡静涛、苏群鸿等研究结果一致，即重组乳酸工程菌可作为候选疫苗进一步开发利用。

本研究将疫苗的免疫预防作用与乳酸杆菌的益生作用有机结合起来, 将水貂源犬瘟热病毒F基因与H基因融合在一起，构建了含有F基因和H基因的重组乳酸工程菌，为以乳酸杆菌为载体的新型疫苗系统的研发以及动物疾病的预防提供新的思路。

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(编辑：陈希)

Construction and Expression of RecombinantLactobacillusContaining F-H Fusion Gene of Canine Distemper Virus from Mink

SU Feng-yan1,LI Zhe1,LI Yan-zhi2,WANG Cun-feng3,ZENG Fan-li1

(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changcun130118,China;2.AnimalHusbandryWorkStationofYtongManzhuAutonomousCountyinJilinProvince,Jinlin,Ytong130700,China;3.ResearchCenterofAnimalProbioticsEngineeringinJilinProvince,Changcun130118,China)

In order to constructLactobacilluscontaining a F-H fusion gene of canine distemper virus(CDV), the F-H fusion gene was amplified by gene splicing by overlap extension PCR(SOE-PCR).The F-H fusion gene was sub-cloned into shuttle carrier pSIP409 to construct a recombinant plasmid(named as pSIP-F-H).Then the recombinant plasmid pSIP-F-H was elec-transformed intoLactobacillusplantarumcompetence cells. SDS-PAGE and Western-blot were used to detect the expression of F-H fusion protein. In results, the F-H fusion gene of CDV was amplified successfully. The recombinant plasmid pSIP-F-H was constructed and elc-transformed intoLactobacillusplantarumcompetence cells successfully. Results of SDS-PAGE and Western-blot showed that recombinantLactobacillusexpressed a fusion protein (nearly 62.96 ku in size) and the protein can react with CDV positive antibody.

canine distemper virus; F-H fusion gene;Lactobacillus; expression

吉林省重点科技攻关项目(20130206039NY)

苏凤艳，博士,教授,从事经济动物疾病防治方面研究。E-mail:sufy110@163.com

2016-07-29

A

1002-1280 (2016) 09-0015-07

S852.6