黄连总生物碱对结核菌PhoPR 双组份系统基因转录水平影响的研究

曾范利，于丹，姜园园，时坤，李健明，宗颖，赵丹，杜锐，4*

(1. 吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2. 长春市动物疫病预防控制中心，长春 130061；3. 吉林农业大学农业质量标准与检测技术研究中心，长春 130118；4. 吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，长春 130118)

黄连总生物碱对结核菌PhoPR 双组份系统基因转录水平影响的研究

曾范利1，于丹2，姜园园1，时坤1，李健明1，宗颖1，赵丹3，杜锐1，4*

(1. 吉林农业大学中药材学院，长春 130118；2. 长春市动物疫病预防控制中心，长春 130061；3. 吉林农业大学农业质量标准与检测技术研究中心，长春 130118；4. 吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，长春 130118)

为研究黄连总生物碱对结核菌PhoPR双组份系统基因转录水平的影响，对不同药物作用的菌液提取总RNA并进行反转录，根据GenBank 中H37Rv的PhoP (0757) 基因、PhoR(0758) 基因和SigA的基因序列，应用Primer6.0软件设计荧光定量引物并进行荧光定量PCR分析。结果显示：在高浓度黄连生物碱作用时，多药耐药结核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表达水平明显下降，并且黄连总生物碱与RPF联合作用时，多药耐药结核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表达水平明显下降，表明黄连生物碱是RFP抗菌增效剂。本试验为结核菌抗菌增效作用机制研究奠定了理论基础。

黄连总生物碱；结核菌；PhoPR 双组份系统；转录水平

鹿结核病是由结核分枝杆菌引起的鹿的慢性消耗性传染病，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见，严重威胁着养鹿业的健康发展[1]。病鹿尤其是具有开放性结核的病鹿是人类结核病的主要传染源之一。由于结核分枝杆菌为长期胞内寄生菌，可以长期处于休眠状态，没有有效的疫苗和药物进行控制，为降低结核病给公共卫生和人类带来的危害，大部分发达国家采用检疫和扑杀相结合的方式来消除结核病[2]，但是检疫和扑杀不是根除动物结核病和人类结核病的长期有效方法。近年来随着耐药性结核菌株的增加，多药耐药结核病的防治已成为难题[3]。

结核菌PhoPR双组份系统是对外环境变化作出感知的重要系统，在外界环境变化时，PhoPR双组份系统会对结核分枝杆菌做出相应的调控，使结核分枝杆菌更容易适应生长环境的变化[4]。有报道表明，PhoPR可能与结核分枝杆菌的致病力、毒性作用、细胞膜的通透性、外排泵、耐药性和新型疫苗的研制有关[5]。PhoPR双组分系在结核分枝杆菌的致病作用中扮演着重要的角色，而且是一个潜在的候选目标[6]。因此本试验以标准人型结核分枝杆菌H37Rv为对照菌株，以鹿源多药耐药结核菌为试验模型菌，选择PhoPR双组份系统为研究对象，在国内率先研究本课题组前期筛选出的RFP的抗菌增效剂黄连总生物碱对PhoPR双组份系统基因表达的影响，初步探讨黄连总生物碱作为结核菌抗菌增效剂的作用机制并且为多药耐药结核病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂 标准人型结核分枝杆菌H37Rv、鹿源耐药性牛型结核分枝杆菌(MB-1)和耐药性人型结核分枝杆菌(MT-7)由吉林大学于录教授惠赠；黄连总生物碱为实验室提取保存；利福平(rifampicin, RFP) 购于中国药品生物制品检定所；小檗碱(Berberine)购于成都普菲德生物技术有限公司；Middlebrook7H9肉汤和Middlebrook-OADC增菌液购于BD Difco 公司；β-巯基乙醇购于Sigma公司；DEPC和缓冲溶液(TE butter)购于维特杰生物技术有限公司；细菌RNA提取试剂盒(RNApure Bacteria Kit，CW0536)和溶解酶(Lysozyme，CW0887)购于康为世纪公司， SYBR®Premix EX TaqTMⅡ和PrimescriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase购于大连TaKaRa公司。

1.2 菌液及药物菌液的制备 标准菌H37Rv、鹿源耐药性结核分枝杆菌MB-1、MT-7以无菌7H9培养基培养5～10 d后，将菌液移至含有直径为1 mm玻璃珠的10 mL的离心管中，于漩涡震荡仪上震荡、打碎，取上层菌液加入与麦氏比浊管同样大小的试管中，以无菌7H9肉汤培养基稀释成1号麦氏比浊管浓度，并无菌稀释20倍制备成20 mL的菌液。

黄连总生物碱单用：分别向H37Rv、MB-1、MT-7的20 mL菌液加入黄连总生物碱，使黄连总生物碱的终浓度为0、1/4、1/2、1 MIC(μg/mL)。加入之后37 ℃，无菌培养5～10 d，至肉眼可见菌膜生成及对数生长期。

黄连总生物碱与RFP联用：分别向H37Rv、MB-1、MT-7的20 mL菌液加入黄连总生物碱和利福平，终浓度为黄连总生物碱(单独)：1/4MIC(μg/mL)，RFP(单独)：1/4MIC(μg/mL)，黄连总生物碱1/4MIC(μg/mL)+ RFP 1/4MIC(μg/mL)及无药空白培养基。加入之后37 ℃，无菌培养5～10 d，至肉眼可见菌膜生成及对数生长期。

1.3 结核分枝杆菌总RNA的提取及反转录 将培养好的菌液移至2 mL的离心管中，4 ℃，10000 r/min离心4 min收集菌体，清洗菌液2次，然后小心除净上清液，将菌体移至处理好的预冻研钵中，倒入液氮，快速研磨至白粉末状，重复2次，然后按照细菌RNA提取试剂盒RNApure Bacteria Kit-CW0536说明书操作，获得结核分枝杆菌总RNA，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量并用超微量快速核酸测定仪检测总RNA含量。采用PrimescriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase反转录试剂盒进行去除基因组DNA和反转录两步反应。按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 PhoPR双组份系统的PhoP、PhoR基因和SigA内参基因的引物设计及荧光定量PCR 根据GenBank中H37Rv的PhoP(0757)基因、PhoR(0758)基因和SigA的基因序列，应用Primer6.0软件设计荧光定量引物如(表1)并由大连宝生物公司合成。通过梯度PCR摸索，PhoP、PhoR和SigA的基因引物的最适宜退火温度分别为62 ℃、62 ℃、60 ℃。反应的条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60～62 ℃退火/延伸30 s，总共进行40个循环，根据荧光信号获得扩增曲线；反应后进行溶解曲线的反应，反应条件为95 ℃ 15 s，60 ℃持续15 s，从60 ℃增至95 ℃保持20 min。

表1 荧光定量PCR引物

1.5 数据处理及分析 基因表达量分析以内参为对照，采用2-△△Ct分析方法进行数据的统计分析，通过SPSS Statistics 17.0进行差异性检验分析。

2 结果

2.1 总RNA的质量与含量的测定结果 H37Rv、MB-1、MT-7的RNA的OD260/OD280比值均在1.9～2.0之间，表明总RNA的含量符合要求。通过RNApure Bacteria Kit试剂盒获得RNA，电泳之后可见两条明显的条带，分别为16S、23S条带(图1)，表明总RNA的质量符合后续试验的要求。

M：DL 2000；1：0 MIC黄连总生物碱；2：1 MIC黄连总生物碱；3：1/2 MIC黄连总生物碱；4：1/4 MIC黄连总生物碱；5：1/4 MIC 利福平；6：1/4 MIC黄连总生物碱+1/4 MIC 利福平图1 六个浓度药物作用结核分枝杆菌的RNA电泳图

2.2 PhoP、PhoR基因的mRNA相对表达量 耐药菌株MB-1、MT-7的PhoP的基因表达量分别是H37Rv的16.7倍和7.5倍，P<0.05有统计学意义，耐药菌株MB-1、MT-7的PhoR的基因表达量分别是H37Rv的4.7倍和8.2倍，差异有统计学意义P<0.05(图2)。

图2 H37Rv、MB-1、MT-7的PhoP和PhoR基因表达水平

2.3 黄连总生物碱作用下PhoP、PhoR基因的mRNA相对表达量 随着黄连浓度的增加，H37Rv的PhoP、PhoR 基因的表达处于上升趋势，P>0.05无统计学意义；MB-1、MT-7的PhoP、PhoR 基因表达处于上升后下降的趋势，P<0.05有统计学意义。黄连总生物碱浓度为1/4MIC时MT-7的PhoP、PhoR基因表达原始状态相比相差不大，MB-1的PhoP、PhoR基因表达是原始状态的6.9倍和5.4倍；黄连总碱浓度为1/2MIC时MT-7的PhoP、PhoR基因表达比原始状态下调了0.82倍和0.86倍，MB-1的PhoP、PhoR基因表达量与原始状态相差不大；黄连总碱浓度为1 MIC时MT-7的PhoP、PhoR基因表达量比黄连总碱浓度为1/4MIC时下调1.3倍和1.2倍，MB-1的PhoP、PhoR基因表达量比黄连总碱浓度为1/4MIC时下调5.4倍和4.1倍(图3)。

图3 黄连总生物碱作用下H37Rv、MB-1、MT-7的PhoP、PhoR基因表达水平

2.4 黄连总生物碱与RFP作用下PhoP、PhoR基因的mRNA相对表达量 虽然H37Rv在药物黄连总生物碱与RFP药物作用下PhoP、PhoR基因的表达量有所差异，但P>0.05无统计学意义；MB-1、MT-7在药物黄连总生物碱与RFP作用下PhoP、PhoR基因的表达量有所差异，而且MB-1、MT-7在药物黄连总生物碱与RFP联用的作用下，PhoP、PhoR基因的表达量均比在单独用黄连和单独用RFP的表达量降低了，差异有统计学意义，P<0.05(图4)。

图4 黄连总生物碱和RFP作用下H37Rv 、MB-1、MT-7的PhoP、PhoR 基因表达水平

3 讨论

结核分枝杆菌Pho PR双组分系统是结核分枝杆菌编码的11个完整的双组分系统中最基本、最重要的调节系统。它可以感应外界环境变化，并做出相应反应的调控，能够使结核分枝杆菌更好的适应宿主微环境变化，以及协助结核分枝杆菌逃避宿主的免疫监视和杀灭，促使其在宿主体内生存、繁殖、致病等。同时对结核分枝杆菌在宿主体内的生长、分化、代谢、渗透调节、繁殖、毒性、趋化性、变异性、致病性等方面发挥着重要的调控作用[7-8]。对于PhoRP双组份系统在耐药菌中的调控作用是否伴有相关耐药基因的高表达以及与细菌中的其他调控系统共同发挥作用，其与耐药性之间的关系尚不清楚，还需要进一步研究。

中药是我国历史悠久的自然资源，在治疗疾病方面显示了独特的疗效。研究表明中药中存在潜在的对抗细菌耐药的增敏剂或逆转剂。目前研究抗结核的中药有黄芩、夏枯草、苦参，大蒜素等，而黄连抗结菌研究的较少。黄连的主治功效为清热解毒，消炎止痛，还有抑菌、抗炎的作用，同时提高机体的免疫力，主要成分为小檗碱(黄连素)，以小檗碱研究居多。匡铁吉等[9]发现黄连素(小檗碱)对H37Rv在浓度为100 μg/mL有杀菌作用，60 μg/mL有抑菌作用。目前，对于黄连总生物碱的研究较少，且集中于黄连总生物碱的降血糖、胃粘膜损伤的保护作用等，而对结核菌的作用未见报道。因此，本试验在前期试验的基础上，以黄连总生物碱及与RFP联合作用于标准菌和鹿源多药耐药结核菌，研究黄连总生物碱对结核菌PhoPR双组份系统基因转录水平的影响。

本研究的结果表明，在无药状态下，在耐药菌MB-1、MT-7中PhoP、PhoR基因的表达明显高于在H37Rv的，这可能是由于耐药菌MB-1、MT-7的培养环境发生了改变，PhoPR双组分系统能感知外界环境变化作出反应，使PhoP、PhoR表达提高；在高浓度黄连生物碱作用时，多药耐药结核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表达水平明显下降，说明黄连总生物碱可能降低了MB-1、MT-7的耐药性；并且黄连总生物碱与RPF联合作用时，多药耐药结核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表达水平明显下降，说明黄连总生物碱与RFP能协同抑制结核菌[10]，表明黄连生物碱是RFP抗菌增效剂，其作用机制有待进一步深入研究，从而为解决动物源结核分枝杆菌的耐药性问题做出有益的探索。

[1] 杜锐. 中国养鹿与疾病防治[M]. 吉林: 中国农业出版社，2010: 404.

[2] Zanella G, Bar-Hen A, Boschiroli M L,etal．Modelling transmission of bovine tuberculosis in Red Deer and Wild Boar in Normandy, France[J]. Zoonoses and Public Health, 2012, 59(2):170-178.

[3] World Health Organization. Global tuberculosis control and patient care: a ministerial meeting of high M /XDR-TB burden countries[R]. Beijing, China, 2009.

[4] Smita M, Shuishu W. Structure of the response regulator PhoP fromMycobacteriumtuberculosisreveals a dimer through the receiver domain[J]. Biochemistry, 2011, 50(26):5948-5957.

[5] Mena C, Christophe T, Amine N,etal. Identification of DNA binding motifs of theMycobacteriumtuberculosisPhoP/PhoR two-component signal transduction system[J]. Plos One, 2012, 7(8): 42876-42876.

[6] Jesús G A, Catarina M, Ferrer N L,etal. The virulence-associated two-component PhoP-PhoR system controls the biosynthesis of polyketide-derived lipids inMycobacteriumtuberculosis[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(3): 1313-1316.

[7] Fontan P, Aris V, Ghanny S,etal. Global transcriptional profile ofMycobacteriumtuberculosisduring THP-1 human macrophage infection[J]. Infect Immun, 2008,76(2):717-725.

[8] Tailleux L, Waddell S J, Pelizzola M,etal. Probing host pathogen cross-talk by transcriptional profiling of bothMycobacteriumtuberculosisand infected human dendritic cells and macrophages[J]. PLoS ONE, 2008, 3(1): 1403.

[9] 匡铁吉，董梅，宋萍，等. 黄连素对结核分枝杆菌的体外抑菌作用[J]. 中国中药杂志，2001，35(12)：71-72.

[10]姜园园，曾范利，杜锐, 等. 抑制鹿源多药耐药结核菌中药的筛选[J]. 动物医学进展，2016，37(4)：54-57.

(编辑：李文平)

Study on the Effect of Transcriptional Level on PhoPR Two-component System Genes byCoptischinensisTotal Alkaloids

ZENG Fan-li1, YU Dan2, JIANG Yuan-yuan1, SHI Kun1,LI Jian-ming1, ZONG Ying1, ZHAO Dan3, DU Rui1,4*

(1.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.ChangchunPreventionandControlCenterofAnimalDisease,Changchun130061,China;3.ResearchCenterofAgricultureQualityStandardandDetectingTechnique,JilinAgricultureUniversity,Changchun130118,China;4.LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

To study the effect of transcriptional level on PhoPR two-component system genes byCoptischinensistotal alkaloids, the different concentrations ofCoptischinensistotal alkaloid or in combination with RFP were applied to detect sensitivity to MT-7, MB-1 and H37Rv. Then the total RNA was extracted and reverse transcribed. The expression level of PhoP and PhoR genes belonging to the PhoPR two-component system which was related to drug resistance were analyzed and compared by realtime fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression level of PhoP and phoR of MT-7, MB-1 was decreased significantly with the high concentration of total alkaloids fromCoptidisrhizoma. The expression of level of PhoP and phoR of MT-7 and MB-1 was decreased significantly byCoptischinensistotal alkaloid combined with RFP. The results showed thatCoptischinensistotal alkaloid was antibacterial synerists of RFP. The result will provide a theoretical basis for mechanism of action of antibacterial synerists.

Coptischinensistotal alkaloids; tuberculosis bacteria; PhoPR two-component system; trans-criptional level

吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204028NY)；吉林省科技厅科技成果转化促进计划(20140309018YY)

曾范利，讲师，博士，从事经济动物疫病与病原学研究。

杜锐。E-mail：durui71@126.com

2016-08-08

A

1002-1280 (2016) 09-0006-05

S852.61