Th17及调节性T细胞及相关因子在颈动脉粥样硬化发生过程中的作用及其机制

郭三强　韩升波　李　敏

(郑州市中医院心内科，河南　郑州　450007)



Th17及调节性T细胞及相关因子在颈动脉粥样硬化发生过程中的作用及其机制

郭三强韩升波1李敏2

(郑州市中医院心内科，河南郑州450007)

〔摘要〕目的探讨T辅助性17(Th17)细胞及CD4+CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞及相关因子在颈动脉粥样硬化(AS)患者外周血中的表达水平及Th17细胞影响AS发病的机制。方法选取2012年7月至2014年7月来该院治疗的AS患者(60例)为研究组，选取同期来该院体检的健康人群为对照组(40例)，采用流式细胞术检测AS患者及正常人外周血中Th17细胞及Treg细胞水平，采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测两组人群外周血中白介素(IL)-17以及转化生长因子(TGF)-β的水平；采用RT-PCR法检测两组人群外周血中转录因子RORγT及Foxp3的mRNA水平。结果AS患者中Th17细胞比例，血清IL-17水平及外周血RORγT mRNA水平显著高于AS对照组；Treg细胞比例、血清TGF-β水平及外周血Foxp3 mRNA水平显著低于对照组(P<0.01)。结论Th17细胞及相关因子可能参与促进AS的产生，Treg细胞及相关因子可能参与抑制AS的产生，阻断AS患者体内的IL-17可能作为治疗AS的潜在手段。

〔关键词〕Th17；调节性T细胞；IL-17；TGF-β；颈动脉粥样硬化

1郑州市中医院消毒供应室2郑州市中医院检验科

第一作者：郭三强(1972-)，男，硕士，副主任医师，主要从事冠心病方面的研究。

目前，在动脉粥样硬化(AS)的发病过程中的细胞学机制尚未完全清楚。CD4+T细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞，在抗原与抗原提呈细胞(APC)存在时可以分化为不同亚群，包括Th1、Th2、Th17及Treg细胞〔1~3〕。Th17与Treg功能上的失衡可能在AS的形成发展中起着重要的作用：Th17细胞是一群在TCR通路和细胞因子白介素(IL)-6及转化生长因子(TGF)-β的刺激下分化的细胞亚群〔4〕，该细胞群参与AS的慢性炎症病理过程〔5〕；Treg细胞则是一类调控机体免疫功能的细胞群，能维持免疫系统对自身成分的耐受，使机体保持免疫稳态。研究发现，Apoe-/-小鼠体内Treg细胞能够通过产生IL-10水平来减轻病理免疫反应，减慢AS的形成〔6〕。目前，对于Th17/Treg在AS形成的具体作用及机制尚不完全明了，本研究旨在探讨Th17及Treg细胞与AS的联系。

1资料与方法

1.1临床资料选择2012年7月至2014年7月入住我院的60 例AS患者为研究组，同时选取同期40例健康体检者作为对照组。研究组通过颈动脉彩超证实有AS，其中男25例，女35例，年龄42~68岁(55.26±8.32)岁；对照组男14例，女26例，年龄44～67岁，平均(54.51±9.17)岁。两组患者的性别、年龄等一般资料方面无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1Th17细胞及Treg细胞流式染色两组患者均在早晨空腹采集外周血5 ml，加入EDTA抗凝剂和红细胞裂解液裂解红细胞后，以完全1640培养液调节浓度至1×106/ml。Th17细胞染色：离心并重悬于100 μl磷酸盐缓冲液(PBS)中，加入CD3-APC(eBioscience，0.2 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.25 mg/ml)抗体，混匀后室温避光孵育40 min，以PBS冲洗，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育30 min，离心后，重悬于100 μl permeabilization buffer中，加入IL-17-PE(BioLegend，0.25 mg/ml)，4℃避光孵育30 min，以PBS缓冲液洗2遍后，以500 μl缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)检测。Treg细胞染色：离心并重悬于100 μl PBS中，加入CD25-APC(eBioscience，0.25 mg/ml)和CD4-FITC(eBioscience，0.25 mg/ml)抗体，混匀后室温避光孵育40 min。以PBS洗1遍，加入破膜固定工作液1 ml后4℃避光孵育40 min，离心后，重悬于100 μl permeabilization buffer中，加入2 μl Fc受体阻断剂(eBioscience)，4℃避光孵育20 min，加入抗FoxP3-PE(eBioscience，0.15 mg/ml)抗体，置4℃避光孵育40 min，以PBS缓冲液冲洗后，以500 μl缓冲液重悬细胞后用流式检测。

1.2.2酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清中IL-17及TGF-β水平所有试剂盒均购自达科为科技有限公司，检测流程严格按照试剂盒的说明书进行。

1.2.3采用RT-PCR法检测外周血中转录因子RORγT及Foxp3的mRNA水平外周血离心后提取上层血浆150 μl，加入到1 ml Trizol充分匀浆，按照说明书的要求抽提总RNA，所得RNA溶于25 μl DEPC处理水中。提取的总RNA经紫外分光光度计进行定量分析，然后再采用Femantes逆转录试剂盒逆转录成cDNA，于-20℃保存备用。本实验PCR反应条件：95℃变性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s进行40个循环。RORγT引物序列：正义：5′-GCAGCGCTCCAACATCTTCT-3′，反义：5′-ACGTACTGAATGGCCTCGGT-3′； Foxp3引物序列：正义：5′-CACCTGGCTGGGAAAATGG-3′，反义：5′-GGAGCCCTTGTCGGATGA-3′； 内参GAPDH引物序列：正义：5′-GCATGGGTCAGAAGGATTCCTc-3′，反义：5′-TCGTCCCAGTTGGTGACGAT-3′。使用ABI公司的7900型号Real-Time PCR仪器进行扩增，所得结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析〔7〕。

1.3统计学分析采用SPSS18.0软件进行t检验。

2结果

2.1两组外周血Th17及Treg水平比较对照组人群外周血中Th17细胞比例〔(0.57±0.41)%〕显著低于研究组〔(1.87±0.31)%〕(t=18.03,P<0.01)；对照组人群外周血中Treg细胞比例〔(1.52±0.47)%〕显著高于研究组〔(0.81±0.38)%〕(t=8.32,P<0.01)。

2.2两组外周血中血清中IL-17及TGF-β水平研究组血清中IL-17水平〔(33.21±8.41)pg/ml〕显著高于对照组〔(17.12±8.80)pg/ml〕(t=9.20，P<0.01)；研究组血清中TGF-β水平〔(17.21±8.73)pg/ml〕显著低于对照组〔(27.21±9.27)pg/ml〕(t=5.47，P<0.01)。

2.3两组外周血中转录因子RORγT及Foxp3的水平研究组外周血RORγT mRNA水平(3.23±0.25)显著高于对照组(1.00±0.09)(t=63.222，P=0.000)；研究组外周血Foxp3 mRNA的表达水平(0.28±0.06)显著低于对照组(1.06±0.13)(t=35.510,P=0.000)。

3讨论

AS是一种主要累及主动脉、冠状动脉、脑动脉、肾动脉和大、中型肌弹力型动脉，从而导致管腔狭窄以至完全堵塞，使这些重要器官缺血缺氧、功能障碍导致机体死亡。AS的主要临床表现为血脂水平的升高，同时伴有炎症和自身免疫系统病变的发生〔8〕。炎症是介导AS发生、发展过程中重要的启动因素，随着炎症的发展，AS患者体内活化的白细胞及内皮细胞等释放出多种细胞因子，如纤维生长因子(FGF)、TGF-β以及表皮生长因子(EGF样因子)等，从而刺激成纤维细胞和平滑肌细胞的增殖及迁移，最终形成内膜纤维肌性增殖性病变，使得AS逐渐加重〔9〕。

Th17及Treg 细胞是CD4+T淋巴细胞两大类重要的亚群。其中，Th17是一群在IL-6、TGF-β等因子诱导下产生的T细胞亚群，该细胞能够通过分泌IL-17参与自身免疫性疾病的机体防御〔10,11〕。Treg细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞亚群，可在存在IL-10和TGF-β等细胞因子的条件下诱导产生，该细胞能够通过分泌TGF-β等因子参与机体多种自身免疫疾病的发生及发展，如系统性红斑狼疮、再生障碍性贫血、Ⅰ型糖尿病等〔11，12〕。

Th17及Treg细胞在AS中也日益受到人们的广泛关注。Zhu等〔13〕认为，在系统性红斑狼疮的患者中，Th17及Treg细胞的失衡能够显著增加AS的发病率。Liu等〔14〕发现，在血管紧张素Ⅱ诱导的AS小鼠模型中，Th17能够促进AS的发生。Rosario Espinoza Mora等〔15〕发现，在心源性休克患者体内Th17细胞数量显著增加，被认为是该病的一个危险因素。在小鼠肝损伤模型中，在雷公藤诱导肝脏损伤的同时，Th17/Treg细胞亦发生失衡，偏向Th17分化〔16〕。本研究结果提示Th17/Treg 细胞的失衡参与了AS患者的免疫应答，这与以往研究认为的Th17可能具有潜在的促进AS的功能相一致〔6,17〕。此外，AS患者中Th17/Treg细胞的失衡可能通过影响分泌的因子来参与调节AS的进程。

Subramanian等〔18〕认为，Treg细胞介导的抑制AS过程主要依赖于Myd88信号途径。而Wasserman等〔19〕发现，IL-33可以通过增加Treg细胞水平来抑制AS的发展。本研究提示了IL-17可能参与并促进AS发病的过程。

4参考文献

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6Mallat Z,Tedgui A.Immunomodulation to combat atherosclerosis:the potential role of immune regulatory cells〔J〕.Expert Opin Biol Ther,2004;4(9):1387-93.

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15del Rosario Espinoza Mora M,Böhm M,Link A.The Th17/Treg imbalance in patients with cardiogenic shock〔J〕.Clin Res Cardiol,2014;103(4):301-13.

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19Wasserman A,Ben-Shoshan J,Entin-Meer M,etal.Interleukin-33 augments Treg cell levels:a flaw mechanism in atherosclerosis〔J〕.Isr Med Assoc J,2012;14(10):620-3.

〔2015-10-08修回〕

(编辑滕欣航)

通讯作者：李敏(1978-)，女，主管护师，主要从事职业防护方面的研究。

基金项目：郑州市2014年市级指导性科技计划项目(No.20140526)

〔中图分类号〕R743.3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)03-0590-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.033