姜黄素对裸鼠人胃癌细胞MMP-2和CD44v6在mRNA水平表达的影响

魏世平　张俊会

姜黄素对裸鼠人胃癌细胞MMP-2和CD44v6在mRNA水平表达的影响

魏世平张俊会

【摘要】目的观察姜黄素对胃癌组织中MMP-2和CD44v6在mRNA水平表达的影响，探讨其抑制胃癌细胞转移的作用机制。方法以SGC-7901胃癌细胞株建立胃癌裸鼠原位移植瘤模型，将裸鼠随机分为对照组及姜黄素组，每组12只。观察裸小鼠胃癌种植后肿瘤生长及转移灶情况，用原位杂交方法检测肿瘤组织中MMP-2mRNA和CD44v6mRNA表达的变化。结果所有荷瘤鼠胃壁均有肿瘤生长，荷瘤率100%，姜黄素组肝、腹腔和淋巴结的转移比对照组明显减少(P＜0.05);姜黄素治疗组瘤体中MMP-2mRNA和CD44v6mRNA的表达明显下调(P＜0.05)。结论姜黄素具有抑制人胃癌裸鼠原位移植瘤转移的作用，其作用机制可能与下调MMP-2mRNA和CD44v6mRNA的表达有关。

【关键词】姜黄素;胃癌;mmP-2; CD44v6

【中图分类号】R 735.2

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2412－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.003

【Abstract】Objective To investigate the effects of curcumin on the expression ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in human gastric cells，and to explore the possible actionmechanisms of curcumin in inhibitingmetastasis of gastric cancer.Methods The orthotopic transplantation tumormodels were established in nudemice with SGC-7901 gastric cancer cell line，then the nudemice were randomly divided into control group and curcumin group，with 12mice in each group.The tumor growth andmetastasis condition were observed，and the expression levels ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in tumor tissue were detected by in situ hybridization.Results The successful rate of orthotopic transplantation tumor was 100%.Themetastases of liver，peritoneal cavity and lymph node in curcumin group were significantly less than those in control group(P＜0.05)，moreover，the expression levels ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in curcumin group were significantly down-regulated，as compared with those in control group(P＜0.05).Conclusion Curcumin can inhibit gastric cancermetastasis in nudemice orthotopic transplantation tumor，and its actionmechanismmight be related to down-regulation of the expression levels ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA.

收稿日期:(2015－02－06)

作者单位: 054000河北省邢台市，邢台医学高等专科学校病理教研室

Influence of curcumin on the expression ofmmP-2mRNA and CD44v6mRNA in human gastric cancer cells in nudemicemodel

WEI Shiping，ZHANG Junhui.Xingtaimedical College，Hebei，Xingtai 054000，China

【Key words】curcumin; gastric cancer;mmP-2; CD44v6

胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在我国，每年死于胃癌患者达16万人，占全部恶性肿瘤死亡人数的23%。胃癌的发生、发展是多因素、多阶段、多基因变异所致的癌变过程。胃癌的单纯手术切除，可获治愈的仅限早期胃癌且不伴有任何转移灶者，有转移灶的早期胃癌及全部进展期胃癌，内科治疗占有重要地位。姜黄素是从植物姜黄的根茎中提取的主要有效成分，大量研究表明，姜黄素具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性［1］。在肿瘤的发生发展过程中，姜黄素通过多种通路和靶点相互作用，发挥抗肿瘤作用［2］。但其抗肿瘤机制较为复杂，至今仍未完全阐明。为此本研究通过建立胃癌模型，进一步探讨姜黄素抑制胃癌细胞转移的作用机制。

1　材料与方法

1.1材料4～6周龄BALB/C nu/nu裸鼠24只，雄性，体重18～21 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，SPF级条件下饲养，合格证号: SCXK(沪)2007-0003。人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海细胞生物研究所;姜黄素为Sigma公司产品。原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司;医用吻合型OB胶购自广州白云医用胶有限公司。

1.2方法

1.2.1裸鼠人胃癌SGC-7901原位移植模型的建立:参照许玲等［3］的方法建立裸鼠人胃癌原位移植模型，选择鼠龄为4～6周的SCID裸鼠，将人胃癌细胞株SGC-7901接种于裸鼠腋部皮下，当皮下瘤体长至0.8 ～1.0 cm左右时，在无菌条件下将瘤组织剔除纤维包膜及出血坏死部分，剥取出来，并将瘤组织小心切成直径1.5mm左右的组织块，转种至其他裸鼠皮下，每只

裸鼠移植1个瘤块，如此反复进行鼠间传代，该实验的原位移植材料是第六代裸鼠的皮下移植瘤。处死传代瘤裸鼠，将肿瘤组织从裸鼠腋部皮下剥取，切开选取生长良好的，淡红色、鱼肉状的瘤组织备用。实验动物进行腹腔麻醉，选择左侧正中旁切口打开腹部，用无菌注射器针头在胃大弯处近胃窦旁划破胃壁浆膜层，将肿瘤组织植入，将1滴医用OB生物胶滴在瘤块表面滴上，覆盖瘤组织表面，待生物胶凝固后在进行缝合关腹。

1.2.2动物分组及给药:移植裸鼠随机分为对照组和姜黄素组，每组12只，于造模后第1天开始给药，姜黄素组给予姜黄素200mg/kg，0.2ml/次，隔日腹腔注射1次，对照组给予同等剂量的0.9%氯化钠溶液。在造模9周后将裸鼠处死。

1.2.3观察转移灶:处死动物后，观察腹腔、肝脏及淋巴结的肿瘤转移情况。根据转移部位的不同进行评分［4］，肝脏转移者为2分，腹腔及淋巴结转移者均为1分，无转移者为0分，比较各组评分，并进行相关的统计学处理。

1.2.4原位杂交法检测胃癌组织MMP-2mRNA和CD44v6mRNA的表达，实验操作步骤按说明书进行，DAB显色苏木素复染。阳性判断标准:mmP-2mRNA(图1)及CD44v6mRNA(图2)表达于细胞浆，以棕黄色颗粒为阳性表达。用半定量积分法判断结果，即对每个点的阳性细胞着色强度及阳性细胞率分别进行分级记分，然后根据两项之和确定其阳性强度。胞浆含棕黄色颗粒者为阳性。阳性着色强度:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分;阳性着色细胞数:每张切片上观察5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞百分比，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～100%为3分。将着色强度与阳性细胞百分比分值相加，0～2分为阴性(－)，3分为弱阳性(+)，4分为轻度阳性(++)，5～6分为(+++)。

1.3统计学分析应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示采用t检验，计数资料采用χ2检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1姜黄素对胃癌转移的影响实验结束后处死裸鼠，观察原位移植瘤生长情况良好，24只裸鼠的胃壁均可见肿瘤的生长和浸润，姜黄素组肝、腹腔和淋巴结转移比0.9%氯化钠溶液对照组明显减少(P＜0.05)。见表1。

2.2姜黄素对裸鼠原位移植瘤MMP-2mRNA及CD44v6mRNA表达的影响MMP-2mRNA及CD44v6mRNA主要表达于肿瘤细胞的胞浆内，呈浅黄色至棕褐色。MMP-2mRNA在姜黄素治疗组阳性表达率为25%，对照组阳性表达率为75%，组间差异有统计学意义(P＜0.05); CD44v6mRNA在姜黄素治疗组仅有33.3%的阳性表达率，而在对照组阳性表达率则高达83.3%，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2，图1～4。

表1　2组裸鼠原位移植瘤转移情况比较　n =12

表2　姜黄素对裸鼠原位移植瘤MMP-2mRNA及CD44v6mRNA表达的影响　n =12，只

图1　2组胃癌细胞MMP-2mRNA的表达情况

图2　2组胃癌细胞CD44v6mRNA的表达情况

3　讨论

姜黄素是一种植物多酚，提取自姜黄科植物的根茎中，它不仅可应用于食物及作料等日常生活，而且还可以应用于抗炎、抗凝、抗动脉粥样硬化等，与此同时也可以应用于抗肿瘤，它的抗癌作用的机制复杂［5］，目前普遍认为其抗肿瘤机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关，在一定程度上还能够抑制肿瘤细胞的产生、生长和转移，并且还具有肿瘤耐药逆转剂的功能，目前是美国所承认的一种预防肿瘤的药物。常宏宇等［6］发现姜

黄素可以增强抗肿瘤药物的药效、降低肿瘤细胞的耐药性。何静等［7］实验证实姜黄素可以抑制血管内皮生长因子表达的，降低肿瘤的侵袭性。Zhang等［8］研究证实姜黄素可以抑制核因子κB的活性，下调增殖相关基因、凋亡相关基因及血管生成素相关的表达，抑制肿瘤细胞的生长。

MMPs是结构高度同源的基质金属蛋白酶家族成员之一，是人体内降解IV型胶原和细胞外基质的主要酶，包括20多个成员，肿瘤细胞以旁分泌的形式刺激MMPs的合成［9，10］，9、10MMPs蛋白表达是预后不良的生物学标志，MMP-2是MMPs家族中重要的一员［11］，MMP-2可通过破坏局部组织结构、基底膜屏障以及促进肿瘤新生血管形成等作用，而在肿瘤的生长、浸润和转移中发挥重要作用［12］。有研究说胃癌中MMP2高表达在血管、淋巴管及淋巴结转移灶的癌栓中，说明MMP2与胃癌的浸润和侵袭有关，可以作为一个指标评价患者预后［13］

研究证实许多恶性肿瘤的侵袭和转移过程中均有MMP-2的过度表达［14，15］。本研究中我们采用原位杂交技术对肿瘤组织中MMP-2mRNA的表达进行检测，研究发现MMP-2mRNA在对照组肿瘤组织内阳性表达率为75%，姜黄素组肿瘤内MMP-2mRNA的表达显著低于生理盐水对照组。

CD44是一种分布极为广泛的细胞膜表面跨膜糖蛋白，属于粘附分子，是透明质酸的受体，主要参与细胞间、细胞与基质之间的特异性粘连过程。它可以直接影响到肿瘤细胞与细胞外基质的结合能力，刺激新生血管的生成，进而影响肿瘤的形成、浸润、侵袭和转移［16］，CD44v6是CD44的一种拼接变构体，是一种与肿瘤转移相关的基因，主要在病理过程中出现，其有助于肿瘤细胞获得转移潜能，其在肿瘤组织中呈现高表达，而在肿瘤发生器官的正常组织中低表达或不表达。

近年研究发现CD44的高表达与多种人体恶性肿瘤的发生发展和侵袭转移有关。临床研究报道，在乳腺癌、口腔癌、前列腺癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、肺癌和肾细胞癌等［17－19］恶性肿瘤中CD44蛋白阳性癌细胞的侵袭转移能力比阴性的更强。CD44蛋白的阳性表达在癌细胞的发生发展及肿瘤的侵袭转移方面起到重要的作用。癌细胞的侵袭转移中CD44蛋白使得肿瘤细胞同质型黏附作用减弱，从同质黏附的原发灶脱离容易，也可以使肿瘤细胞的异质型黏附作用增强，借助黏附而移动和转移。

实验中我们对裸鼠胃癌组织中CD44v6mRNA的表达进行检测，姜黄素组的肿瘤内CD44v6mRNA的表达显著低于生理盐水对照组，表明姜黄素能明显抑制胃癌细胞的CD44v6mRNA的表达。

为了探讨姜黄素抑制胃癌细胞转移的机制，本研究中我们通过建立裸鼠胃癌模型，观察姜黄素对胃癌转移的影响，结果表明，裸鼠胃癌组织中MMP-2mRNA及CD44v6mRNA的表达显著低于生理盐水对照组，而且姜黄素组胃癌的肝、腹腔和淋巴结转移明显少于对照组。综上所述，我们认为姜黄素可以抑制裸鼠胃癌细胞的转移，其抑制胃癌转移的机制可能与通过下调胃癌细胞的MMP-2mRNA及CD44v6mRNA表达相关。

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