注射用紫杉醇(白蛋白结合型)过敏反应原因研究

高玉清　王彩霞　刘勋涛　王红叶　王艳玲　耿玉茹　李春雷

注射用紫杉醇(白蛋白结合型)过敏反应原因研究

高玉清王彩霞刘勋涛王红叶王艳玲耿玉茹李春雷

【摘要】目的探讨注射用紫杉醇(白蛋白结合型)对豚鼠致敏作用的原因。方法从豚鼠血清免疫性试验和大鼠腹腔肥大细胞组胺释放两个方面，评价注射用紫杉醇(白蛋白结合型)的致敏性。结果豚鼠抗注射用紫杉醇(白蛋白结合型)血清能与人血白蛋白产生沉淀线，与空白豚鼠血清不生成沉淀线;紫杉醇注射液1×10－3mg/ml、1× 10－4mg/ml和1×10－5mg/ml可以明显促进大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放，组胺的释放与剂量成正比，与阴性对照组相比具有显著性差异，而注射用紫杉醇(白蛋白结合型)对大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放无影响。结论注射用紫杉醇(白蛋白结合型)对豚鼠的致敏作用是由其辅料-人血白蛋白引起的。

【关键词】紫杉醇;白蛋白;致敏作用

【中图分类号】R 392.33

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2521－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.042

收稿日期:(2015－01－18)

项目来源:石家庄高端医药产业园区创新药物孵化基地课题(编号:2011ZX09401-306)

作者单位: 050035石家庄市，石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司

通讯作者:李春雷，050035石家庄市，石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司;

紫杉醇为天然的广谱抗肿瘤药物，它通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂来实现抗肿瘤作用。紫杉醇对肿瘤细胞的微管具有特异性作用，因此被认为是G2/M期特异性化疗药物［1］。紫杉醇已经证明对多种恶性肿瘤具有明显抗癌活性，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、头颈部肿瘤和胃癌等，是疗效肯定、临床应用广泛的广谱抗肿瘤药物之一，已作为多个肿瘤的一线治疗药物［2］。但因其水溶性差，临床使用需用聚氧乙烯蓖麻油与无水乙醇作为助溶剂，在体内易引起严重的过敏反应、脱髓鞘病变和神经元退行性病变，所以限制了它在临床上的应用［3］。为了解决上述问题，美国Abraxis Bioscience，LLC公司研制出注射用紫杉醇(白蛋白结合型)纳米制剂，商品名为Abraxane。它采用人血白蛋白(HSA)作为载体，通过高压均质技术将紫杉醇和HSA制成紫杉醇结合白蛋白纳米颗粒。由于处方中不含可导致严重过敏反应的溶剂Cremophor EL，因此不需要预先给予抗过敏药物，并且可以将输液时间缩短到30min以内，显著增强了患者的顺应性。我公司对该产品进行了仿制研发，并对自研注射用紫杉醇(白蛋白结合型)与Abraxane进行了豚鼠主动全身过敏试验比较考察，结果发现两药对豚鼠均有相似的主动全身致敏作用。

1　材料与方法

1.1仪器与材料BHC－1000ⅡA/B3型生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司); IX70型倒置荧光显微镜(日本Olympus公司); HERAcell 150二氧化碳培养箱(德国Heraeus贺利氏); AL204电子分析天平(Mettler Toledo);多功能酶标仪: Thermo Fisher Scientific公司，型号Varioskan Flash;低速离心机:河北白洋离心机厂，型号B40型;高压蒸汽灭菌器:日本sanyo电机株式会社，型号MLS－3780;超纯水机:上海而立环保科技有限公司，型号Milli-Q Academic; Gel Doc XR +型凝胶成像仪: BIO-RAD;恒温培养箱:北京市光明医疗仪器厂。

自研注射用紫杉醇(白蛋白结合型): 100mg，石药集团中奇制药技术(石家庄)有限责任公司，批号20121003;市售注射用紫杉醇(白蛋白结合型):商品名Abraxane，100mg，Abraxis BioScience，LLC生产，批

号6102309，进口药品注册证号H20091059;人血白蛋白:10 g/50ml，广东双林生物制药有限公司，批号20111136;紫杉醇原料药: 5 g/瓶，云南汉德生物技术有限公司，批号cp110302; PEG化蓖麻油(Cremophor EL):500 g/瓶，黄色油状液体，巴斯夫有限公司，批号08550768E; Percoll(1.131 g/ml): Pharmaeia公司进口，北京索莱宝公司分装，产品编号P8370; RPMI 1640培基:美国GiBco公司;大鼠组胺(HIS)ELISA检测试剂盒: RD公司，批号20130401; 0.9%氯化钠注射液: 0.9 g/100ml，石家庄四药有限公司，批号120902166;琼脂糖: amresco，1996B504-100G;氨基黑10B:天津市光复精密化工研究所，批号20110311;冰醋酸:国药集团化学试剂有限公司，批号T20100507;甲醇: Fisher公司产品，批号111773;乙醇:西陇化工股份有限公司，批号110601;乙醚:天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20120110。

SPF级健康hartley豚鼠，300～400 g，河北省实验动物中心购得，实验动物生产许可证号SYXK(冀)2008-1-003。SPF级健康SD大鼠，180～220 g，河北省实验动物中心购得，实验动物生产许可证号SYXK(冀)2008-1-003。动物饲养于清洁级环境，动物自由摄食、饮水，室温20～25℃，湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间12 h/12 h，实验动物使用许可证号SYXK(冀)2011-0059。大鼠饮用无菌纯化水，饲以标准大鼠料。

1.2方法

1.2.1主要溶液的配制:注射用紫杉醇(白蛋白结合型):用无菌注射器将0.9%氯化钠注射液20ml沿瓶内壁缓慢注入，静置5min后，轻轻摇动药瓶，让瓶内所用冻干粉完全分散溶解。

MOOC在国内的落地生根与持续发展，必须与国内政策与法律环境相适应，必须与国内用户的实际需求相契合。由已有研究内容可知，国内图书馆界主要侧重介绍国外图书馆参与MOOC的理论成果与实践经验，而基于国内文化及教育管理体制、知识产权法律法规、用户群体分布、图书馆人才储备及技术力量等实际，探讨MOOC环境下国内图书馆功能重构与机构重组，探讨国内图书馆在MOOC课程制作、MOOC资源标引与描述、MOOC资源整合与检索、MOOC资源宣传与推介、MOOC学习辅导、MOOC质量评价、MOOC教学效果评估等方面及环节中本土化的理论研究还很少，也少有图书馆做出相应的本土化尝试。

紫杉醇注射液(Taxol):按紫杉醇注射液配方进行配制，紫杉醇0.65mg，无水乙醇42mg，PEG化蓖麻油57mg，即含1mg紫杉醇的溶液重量为153.3mg。

等渗的100% Percoll溶液配制:在无菌条件下，取9倍体积的1.131 g/ml Percoll溶液加入1倍体积的1.5m NaCl溶液(10×0.9%氯化钠溶液)混合配制成等渗的Percoll溶液，现用现配。

30%的Percoll溶液配制:取3倍体积的100%等渗Percoll溶液加入7倍体积的0.9%氯化钠溶液溶液。

80%的Percoll溶液配制:取8倍体积的100%等渗Percoll溶液加入2倍体积的0.9%氯化钠溶液溶液。

氨基黑染色液:氨基黑10B 0.5107 g，溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合溶液中。

1.5%琼脂的配制:称0.15 g琼脂糖，加入10ml水，微波炉中小功率加热20 s，使琼脂完全溶胀。

漂洗液:量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml混匀。

1.2.2药物对豚鼠血清免疫性试验

1.2.2.1抗血清的制备方法:选用SPF级hartley豚鼠18只，参照普通拉丁方均分3组，每组雌雄各3只，分别是对照药Abraxane组、自研药注射用紫杉醇(白蛋白结合型)组和阴性对照组。对照药组和自研药组按照预实验确定的剂量给药0.625mg/只，给药容积为0.5ml/只，阴性对照组给予等容积的0.9%氯化钠注射液;给药方式为隔日一次腹腔给药，共三次;末次给药后的第11天将豚鼠进行乙醚麻醉，腹主动脉取血，于灭菌后的15ml离心管内静置，离心3 000 r/min ×15min，取上清，为所需要的抗血清。

1.2.2.2空白豚鼠血清的制备:选用SPF级hartley豚鼠6只，进行乙醚麻醉，腹主动脉取血，于灭菌后的15ml离心管内静置，离心3 000 r/min×15min，取上清，为所需要的空白豚鼠血清。

1.2.2.3免疫双扩散试验［4］:取干净的载玻片，平放于实验台(台面要水平)，将融化的琼脂趁热加在载玻片上(约加4ml)，使琼脂铺满整个玻片的表面(注意勿使琼脂流出玻片之外)，令其在室温下冷却凝固。然后用自制打孔器(内径2～3mm)在琼脂上打孔，并用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，不要触及孔周围的琼脂。打好孔后，在凝胶的左上角打孔作为标记。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液及阳性对照血清，每孔加样20 μl，放置湿盒中，37℃水平扩散24 h，然后用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板24 h后，放入0.5%氨基黑溶液中染色，用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清晰为止。

1.2.3药物对大鼠腹腔肥大细胞组胺释放的影响［5］:在过敏反应与类过敏反应中，肥大细胞脱颗粒释放出多种炎性介质，引起过敏症状。肥大细胞在脱颗粒时会大量释放组胺，它是引起过敏及类过敏反应的主要活性物质。检测肥大细胞释放组胺的量，可以了解肥大细胞的脱颗粒情况，从而评价药物的致类过敏性。1.2.3.1分离大鼠腹腔肥大细胞(rat peritonealmast cells，RPMC)方法: CO2窒息机使SD大鼠昏迷，颈动脉放血处死，将大鼠(除头部)浸入75%乙醇消毒2～3min。将消毒后的大鼠固定于超净台内消毒木板上，用75%乙醇棉球消毒皮肤，腹腔注射预冷的RPMI-

1640液15ml，轻轻按摩腹部3min。在无菌条件下切开腹腔，吸取腹腔冲洗液置于离心管中，1 500 r/min，离心10min。离心物弃去上清液，用冷的RPMI-1640液重悬细胞。取细胞悬液，缓慢加入30%:80%的percoll梯度分离液上层，2 500 r/min离心15min。收集下2/3层细胞，用RPMI-1640液清洗2次，1 500 r/min，离心10min。将细胞置于冰上备用。

1.2.3.2药物与肥大细胞的作用: 96孔板中每孔加入肥大细胞悬液200 μl，每孔细胞数2×105/孔，37℃水浴预孵5min。分别加入50 μl各浓度药物使成不同的终浓度(药物终浓度分别为1×10－3、1×10－4和1×10－5mg/ml)，阴性对照加入等量药物稀释液(0.9%氯化钠溶液)，每孔3复孔，继续孵育60min，然后将96孔板置－20℃终止反应。3 000 r/min离心10min分离细胞。上清液封装于1.5ml小管中，－20℃保存待测。

1.2.3.3组胺检测:采用大鼠组胺ELISA检测试剂盒检测上述溶液中组胺的量。

2　结果

2.1免疫双扩散试验结果豚鼠抗对照药血清能与人血白蛋白、对照药和自研药产生沉淀线，与空白豚鼠血清不生成沉淀线，进而证明对照药引发的豚鼠过敏反应是由于异原白蛋白引起的免疫反应。见图1。

图1　免疫双扩散实验结果

2.2药物对大鼠腹腔肥大细胞组胺释放的影响结果

紫杉醇注射液1×10－3mg/ml、1×10－4mg/ml和1×10－5mg/ml可以明显促进大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放，组胺的释放与剂量成正比，与阴性对照组比较差异有显著性。与阴性对照组相比，相同浓度的自研注射用紫杉醇(白蛋白结合型)和市售注射用紫杉醇(白蛋白结合型)对大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放无影响。与等浓度的自研注射用紫杉醇(白蛋白结合型)和市售注射用紫杉醇(白蛋白结合型)相比，紫杉醇注射液1×10－3mg/ml和1×10－4mg/ml浓度对大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放显著增加。自研注射用紫杉醇(白蛋白结合型)和市售注射用紫杉醇(白蛋白结合型)对大鼠腹腔肥大细胞组胺释放差异无统计学意义。见表1。

表1　药物对大鼠腹腔肥大细胞组胺释放的影响

3　讨论

由于紫杉醇在水中不溶，因此将其开发成注射剂的难点就是改善它的溶解性。目前国内市售紫杉醇制剂包括三种，紫杉醇注射液、注射用紫杉醇脂质体和注射用紫杉醇(白蛋白结合型)。紫杉醇注射液为百时美施贵宝公司研制，商品名为Taxol，1993年在美国上市。该品采用聚氧乙烯蓖麻油作为增溶剂，会引起严重的过敏反应，因此给药前需要使用地塞米松、苯海拉明和H2受体拮抗剂对患者进行预处理。注射用紫杉醇脂质体为南京思科药业有限公司研制，商品名为力扑素，于2003年在中国首次上市。该品虽然较普通注射液过敏性有所减轻，但给药前30min仍需进行抗过敏预处理。注射用紫杉醇(白蛋白结合型)为Abraxis Bioscience，LLC研制，商品名为Abraxane，于2005年在美国上市，2009年进入中国，其在临床应用上，不需进行抗过敏预处理，用药更加安全。

石药集团仿制Abraxane研发了注射用紫杉醇(白蛋白结合型)，豚鼠主动全身过敏试验发现石药集团的注射用紫杉醇(白蛋白结合型)和Abraxane对豚鼠均有主动全身致敏作用，致敏症状基本一致。为了解释注射用紫杉醇(白蛋白结合型)产生致敏的原因，我们进行了大鼠腹腔肥大细胞组胺释放试验和免疫双扩散试验。

在过敏反应与类过敏反应中，肥大细胞脱颗粒释放出多种炎性介质，引起过敏症状。肥大细胞在脱颗粒时会大量释放组胺，它是引起过敏及类过敏反应的主要活性物质［5］。检测肥大细胞释放组胺的量，可以了解肥大细胞的脱颗粒情况，从而评价药物的致类过敏性。Taxol的过敏反应是由于Cremophor EL(聚氧乙烯蓖麻油)促进组胺释放引起的。本研究结果已经证明，紫杉醇注射液1×10－3、1×10－4和1×10－5mg/ml

可以明显促进大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放，组胺的释放与剂量成正比，与阴性对照组相比具有显著性差异。

注射用紫杉醇(白蛋白结合型)由于不含有Cremophor EL，不会引起组胺释放，从而不产生过敏反应，然而石药集团开发的注射用紫杉醇(白蛋白结合型)和Abraxane，对豚鼠均有主动全身致敏作用，为了解释注射用紫杉醇(白蛋白结合型)产生致敏的原因，我们进行了免疫双扩散试验。注射用紫杉醇(白蛋白结合型)之所以对豚鼠有主动全身致敏作用，是由辅料HSA进入豚鼠体内后产生的免疫反应引起的。HAS对于豚鼠来说，是一种异源蛋白，重复给药后，免疫系统必然应答，从而产生抗体。因此自研注射用紫杉醇(白蛋白结合型)与Abraxane所引发的豚鼠过敏反应原因一致，都是由于辅料HAS引起的免疫反应。而HAS是人的内源性蛋白，因此注射用紫杉醇(白蛋白结合型)对豚鼠产生的全身主动过敏症状在人身上不会发生。

参考文献

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3 Gelderblom H，Verweij J，Nooter K，et al.Cremophor EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation.Eur J Cancer，2001，37:1590-1598.

4中华人民共和国药典委员会主编.中国药典·2010年版三部.北京:中国医药科技出版社，附录ⅧC.

5 Krüger PG，Mahata SK，Helle KB.Catestatin(CgA344-364)stimulates ratmast cell release of histamine in amanner comparable tomastoparan and other cationic charged neuropeptides.Regul Pept，2003，114:29-35.