非诺贝特与吡格列酮对佐剂性关节炎大鼠抗炎作用研究

陈虹

非诺贝特与吡格列酮对佐剂性关节炎大鼠抗炎作用研究

陈虹

【摘要】目的探讨非诺贝特与吡格列酮对佐剂性关节炎大鼠的抗炎效果。方法24只雄性Lewis大鼠随机分成4组，空白组、模型对照组:给予等量的羧甲基纤维素;非诺贝特组: 100mg·kg－1·d－1、吡格列酮组: 30mg·kg－1·d－1，于造模后开始给药，共给药21 d。大鼠尾静脉皮内注射完全弗氏佐剂每只0.1ml，制备AA大鼠模型。关节炎的严重程度是由临床观察(体重，关节炎指数评分，足跟肿胀度)进行评估。骨密度(BMD)，骨矿物质含量(BMC)于给药20 d由双能X线骨密度仪测定。应用real-time PCR法检测IL-1β，IL-6和IL-10mRNA的表达水平。结果与模型对照组相比，非诺贝特组和吡格列酮组关节炎指数评分和足跟肿胀度明显降低(P＜0.05)，骨密度和骨矿物质含量明显增加(P＜0.05)，IL-1β和IL-6mRNA的表达水平明显增加(P＜0.05)，IL-10mRNA的表达水平降低(P＜0.05)。结论非诺贝特和吡格列酮对大鼠佐剂性关节炎具有一定的治疗作用。

【关键词】佐剂性关节炎;非诺贝特;吡格列酮;骨

【中图分类号】R 966

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2015)16－2422－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2015.16.006

【Abstract】Objective To investigate the anti-inflammatory effect of fenofibrate and pioglitazone on adjuvant arthritis(AA)in rats.Methods Twenty-fourmale Lewis rats were randomly divided into four groups.The rats in blank group andmodel group were treated orally with same doses of carboxymethylcellulose for 21 days，however，the rats in fenofibrate group or pioglitazone group were treated orally with fenofibrate 100mg－1·kg－1day－1or pioglitazone 30mg－1·kg－1·day－1for 21 days，respectively.The ratmodels with AA were established by caudal vein intradermal injection with complete Freund’s adjuvant 1mg/each rat.The severity of AA was evaluated by observing clinical indexes including body weight，AA index score，swelling degree of heel.Bonemineral density(BMD)and femoral bonemineral content(BMC)weremeasured by dual-energy X-ray absorptiometry at day 20.The expression levels of IL-1β，IL-6 and IL-10mRNA were detected by Real-time RT-PCR.Results As compared with those inmodel group，the AA index score and swelling degree of heel were significantly decreased in fenofibrate group(100mg－1·kg－1·d－1)and pioglitazone group(30mg－1·kg－1·d－1)(P＜0.05)，however，BMD and BMC were significantly increased，so were the expression levels of IL-1β，IL-6mRNA(P＜0.05)，but the expression levels of IL-10mRNA were obviously decreased(P＜0.05).Conclusion Both pioglitazone and fenofibrate have certain therapeutic effects on experimental adjuvant arthritis in rats.

收稿日期:(2015－02－03)

作者单位: 300162天津市，武警后勤学院附属医院药材科

The anti-inflammatory effect of fenofibrate and pioglitazone on adjuvant arthritis in rats

CHEN Hong.Department of Pharmacy，Affiliated Hospital of Tianjin Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China

【Key words】adjuvant arthritis; fenofibrate; pioglitazone; bone

基因转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)属核激素受体超家族，是一种细胞核内受体，由激活剂活化后可调控多种核内靶基因的表达，影响人体糖脂代谢、细胞发育等过程［1］。PPARs共有PPARα、PPARγ、PPARδ三种亚型。PPAR-α和PPAR-γ是PPARs家族的主要成员，参与脂质代谢、炎症、能量动态平衡和胰岛素敏感性调节等许多生物学过程，它们的相关作用可能与脂肪因子和脂肪细胞来源的信号分子有关［2］。非诺贝特(Fenofibrate)是PPARα激动剂，目前临床上用于降血脂的药物［3］。吡格列酮(Pioglitazone)是PPARγ激动剂，作为一种新型胰岛素增敏剂，与胰岛素抵抗和糖脂类代谢密切相关，主要用于降低II型糖尿病患者血糖［4］。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种不明病因的慢性和系统性自身免疫性疾病。RA以慢性疼痛和多关节的肿胀为主要临床表现，主要导致滑膜增生，骨质破坏和软骨退化等病理特征［5］。本研究中，比较PPAR-α激动剂(非诺贝特)和PPAR-γ激动剂(吡格列酮)对关节炎发展和炎性因子的影响。

1　材料与方法

1.1动物与试剂Lewis大鼠24只，雄性，清洁级，体重150～175 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，适应喂养7 d用于实验。非诺贝特(每片100mg):徐州恩华制药厂;吡格列酮(每片15mg):北京太洋药业有限公司;完全弗氏佐剂(Freund’s adju-

vant)，Sigma公司产品;

1.2实验分组24只大鼠随机分为4组，每组6只:空白组、模型对照组、非诺贝特组:100mg·kg－1·d－1、吡格列酮组:30mg·kg－1·d－1。非诺贝特和吡格列酮均溶于水后口服给药，根据体重按1ml/100 g给药，空白对照组和模型组给予等量的羧甲基纤维素。

1.3佐剂性关节炎(AA)大鼠模型的建立及给药除空白组外，另3组18只大鼠，将大鼠右后跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎，制成AA模型，致炎当天记为0 d。治疗组从0～21 d持续给药。

1.4检测指标

1.4.1体重:所有大鼠每4天测量1次体重，从第0 ～21天。

1.4.2关节炎指数评分:造模后12 d，每隔3～4 d对4组大鼠进行关节炎指数评分: 0分:关节无红肿; 1 分:小趾关节稍肿;2分:合足趾和趾关节肿胀;3分:踝关节以下足爪肿胀; 4分:包括踝关节全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的关节炎指数评分，每只大鼠分数最高16分。

1.4.3足跟肿胀度的测定:分别于造模第0、5、9、13、17、20天使用足跖容积测量仪测量大鼠对侧脚踝关节及足跖部肿胀，详细记录计算肿胀度(ml)。

1.5骨密度测量采用GE Lunar Prodigy型双能X线骨密度仪分别于20 d检测大鼠整体及左股骨为兴趣区(ROI)的骨密度值(Bonemineral density，BMD)(g/cm2)和0～20 d检测整体骨矿物质含量(Bonemineral content，BMC，g/cm)，每组数据重复测量3次取平均值。

1.6 RT-PCR检测细胞因子mRNA的表达情况末次给药后2 h，无菌分离滑膜组织，液氮中保存备用。以TRIZOL提取组织中的总RNA，取1 μg总RNA配置逆转录反映体系，逆转录合成cDNA，并以此为模板利用PCR方法进行扩增。其中在PCR反应中所使用的引物分别为: IL-1β:正义链，5’-CAAGTCTCCCACCAGCTCTGTA-3’，反义链，5’-GGGCTTCTTCAGCTTCTCCAA-3’; IL-6:正义链，5’-TTAAGTACATCCTCGGCAAAATCT-3’，反义链: 5’-CAGTGCCTCTTTGCTGTCTTCA’; IL-10:正义链，5’-CGGGAGGGTGAAGACTTTCT-3’，反义链，5’-GGCATCACCTCCTCCAAGTA-3’［6］。检测按照实验室常规方法进行PCR扩增。定量PCR采用的体系为: dNTPs 2 μl，10×buffer 5 μl，上下游引物各10 pmol，Pfu酶0.5 μl，模板2 μl，加三蒸水至总体积50 μl;扩增条件为:预变性94℃5min，进入循环，变性94℃1min，退火60℃ 1min，延伸72℃3min，30个循环后，72℃延伸5min。以β-actin为内参，依据2-ΔΔCT法计算各组细胞mRNA的相对表达量。

1.7统计学分析应用SPSS 16.0统计软件，计数资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1非诺贝特和吡格列酮对大鼠关节损伤程度的影响4组大鼠体重均有所增加，AA大鼠体重8 d达到高峰，之后随之下降，模型对照组和吡格列酮组体重变化相似，非诺贝特组AA大鼠接受药物治疗12 d后，体重较模型对照组明显增加(P＜0.05)。见图1，表1。

图1　4组大鼠体重

表1　4组大鼠体重　g

非诺贝特和吡格列酮用药12 d后与模型对照组比较关节炎指数评分明显降低，用药12 d，16 d，20 d差异有统计学意义(P＜0.05)。非诺贝特组优于吡格列酮组。见图2，表2。

图2　4组大鼠关节炎指数评分重

表2　4组大鼠关节炎指数评分

非诺贝特和吡格列酮用药1～8 d时与同期空白

组和模型对照组相比，足肿胀无明显变化，甚至有个别加重趋势。待用药后8 d后，非诺贝特和吡格列酮用药AA大鼠关节肿胀度较模型组有降低趋势，用药12 d，16 d，20 d差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3，表3。

图3　4组大鼠肿胀度

表3　4组大鼠肿胀度　ml

2.2非诺贝特和吡格列酮对AA大鼠BMD和BMC的影响采用双能X线骨密度仪检测BMD和BMC的改变，非诺贝特组AA大鼠接受药物治疗20 d后，全身及ROI区骨密度较模型对照组明显改善(P＜0.05)，吡格列酮组与模型对照组无显著性差别。AA大鼠ROI区骨矿物质含量(BMC)明显降低，非诺贝特和吡格列酮治疗后，AA大鼠BMC含量明显增加(P ＜0.05)。见图4、5，表4、5。

图4　非诺贝特和吡格列酮对AA大鼠BMD的影响

表4　非诺贝特和吡格列酮对AA大鼠BMD的影响

图5　非诺贝特和吡格列酮对AA大鼠BMC的影响

表5　非诺贝特和吡格列酮对AA大鼠BMC的影响　g/cm

2.3 PPAR激动剂对细胞因子的表达RT-PCR法检测滑膜组织中IL-1β和IL-6mRNA的表达水平，模型对照组中IL-1β和IL-6的表达均高于空白组，非诺贝特和吡格列酮可使AA大鼠IL-1β和IL-6mRNA的表达降低。模型对照组中IL-10的含量显著低于正常组，连续给药21 d后，非诺贝特和吡格列酮可显著提高IL-10mRNA水平的表达量。见图6，表6。

图6　非诺贝特和吡格列酮对IL-1β、IL-6和IL10mRNA表达的影响

表6　非诺贝特和吡格列酮对IL-1β、IL-6和IL-10mRNA表达的影响

3　讨论

贝特类降脂药和格列酮类降糖药分别被确认为是PPAR-α和PPAR-γ的特异性激活剂，同时它们对炎症反应的控制作用，也逐渐引起了人们的重视［7］。有关PPAR-α和PPAR-γ激活剂在关节炎中的抗炎作用报道极少。类风湿关节炎(RA)是关节和关节周围组织，以非化脓性炎症为主的慢性自身免疫性疾病［8］。早期表现为关节明显肿胀，滑膜红肿，多侵犯小关节如手、腕和足，对称性发生较多见。AA动物模型于是目前研究RA应用较为广泛的动物模型，普遍认为AA在临床表现、血清学特点和病理改变等方面与RA非常相似，是研究、筛选治疗RA药物常用的模型之一。IL-lβ是一种在RA患者关节滑液、滑膜组织和血液中均可测到的促炎因子［9］。IL-6是RA患者滑膜组织中存在较为广泛的细胞因子，主要来源于成纤维样滑膜细胞和B型滑液衬细胞，因此它的释放与关节损伤直接相关［10］。IL-10是体内最主要的抑炎性细胞因子，主要由Th2细胞、单核/巨噬细胞等分泌，抑制单核巨噬细胞的激活、粘附与迁移及炎症因子的合成和释放，减轻全身及关节局部炎症反应［11］。

本研究中，非诺贝特100mg·kg－1·d－1、吡格列酮30mg·kg－1·d－1可降低关节炎的严重程度，如肿胀度和关节炎指数评分，并使AA大鼠体重上升。双能X线骨密度仪检测全身及ROI区BMD和BMC的变化，非诺贝特组全身及ROI区BMD较模型对照组明显改善，吡格列酮组与模型对照组无显著性差别。非诺贝特和吡格列酮治疗后，AA大鼠BMC含量明显增加。同时，非诺贝特和吡格列酮可使AA大鼠IL-1β 和IL-6mRNA的表达水平降低，显著提高IL-10mRNA的表达水平。综上所述，本研究结果提示非诺贝特和吡格列酮对大鼠佐剂性关节炎具有一定的治疗作用，为其临床用治疗类风湿性关节炎提供有力的实验基础。

参考文献

1叶平，方红，周新，等.非诺贝特和吡格列酮对心肌细胞肿瘤坏死因子-α表达的影响及机制初探.中国药学杂志，2004，39:258-261.

2吕齐欢.非诺贝特、吡格列酮对SD大鼠Visfatin蛋白表达的影响.安徽医科大学学报，2009，44:688-699.

3 Simo R，Roy S，Behar-Cohen F，et al.Fenofibrate: a new treatment for diabetic retinopathy.Molecularmechanisms and future perspectives.Currmed Chem，2013，20:3258-3266.

4 Ghavimi H，Hassanzadeh K，Maleki-Dizaji N，et al.Pioglitazone preventsmorphine antinociception tolerance and withdrawal symptoms in rats.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2014，32:127-132.

5胡伟.阻断酸敏感离子通道1a对佐剂性关节炎大鼠关节软骨保护作用的细胞分子机制研究.安徽医学，2011，32:671-673.

6 Tamura Y，Ohta H，Yokoyama N，et al.Evaluation of Selected Cytokine Gene Expression in Colonicmucosa from Dogs with Idiopathic Lymphocytic-Plasmacytic Colitis.J Vetmed Sci，2014，42:397-402.

7 IbrahimmA，El-Sheikh AA，Khalaf HM，et al.Protective effect of peroxisome proliferator activator receptor(PPAR)-alpha and -gamma ligands againstmethotrexate-induced nephrotoxicity.Immunopharmacol Immunotoxicol，2014，36:130-137.

8 Abbott JD，Moreland LW.Rheumatoid arthritis: developing pharmacological therapies.Expert Opin Investig Drugs，2004，13:1007-1018.

9牛拴成，张轩萍，杨彩红，等.祛风息痛丸对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用.中国药理学与毒理学杂志，2007，21:422-426.

10 Hashimotom，Fujii T，Hamaguchim，et al.Increase of Hemoglobin Levels by Anti-IL-6 Receptor Antibody(Tocilizumab)in Rheumatoid Arthritis.PLoS One，2014，9: e98202.

11 Bouma G，Carter NA，Recherm，et al.Exacerbated experimental arthritis in Wiskott-Aldrich syndrome protein deficiency:modulatory role of regulatory B cells.Eur J Immunol，2014，17:341-344.