子宫内膜异位症在位子宫内膜间质及腺上皮细胞高纯度分离培养技术的改进

余莎，谢梅青

（1.广东省深圳市第二人民医院 妇科，广东 深圳 518000；2.中山大学附属第二医院 妇产科，广东 广州 510120）

子宫内膜异位症（endometriosos, EMs）体外模型是研究其发病机制及探讨新的治疗方法的工具。模型可分为两种，一种是在体模型，还有一种是离体模型。由于人子宫内膜间质细胞及腺上皮细胞还没成功建立体系，因此，原代培养成为了EMs的重要体外研究方法。现今，和腺上皮以及宫内膜间质分离培养的相关文献非常的多[1]，但未检索到比较EMs在位子宫内膜和正常子宫内膜分离培养方法差异的文献。本研究的目的是对EMs患者在位子宫内膜腺上皮及间质细胞进行高纯度分离、培养，从而对子宫内膜细胞常规培养方法做出改进。

1 资料与方法

1.1 临床资料及子宫内膜组织标本的获取

随机选取2007年7月-2012年3月在深圳市第二人民医院及中山大学附属第二医院妇产科住院治疗的手术患者共12例，年龄25～40岁，分为EMs组和正常组。EMs组选择有不孕症史的因子宫腺肌病或卵巢子宫内膜异位囊肿手术治疗的患者7 例，所有病例均经腹腔镜或开腹手术确诊，分期不限；正常组选择已正常生育的非子宫内膜异位症、非子宫内膜病变及非恶性肿瘤的入院手术患者5例。所有患者术前3个月未使用激素类药物，行腹腔镜术之前，通过患者的阴道取样，或者直接对切除的子宫进行刮取，将采集的子宫内膜立刻置于无菌的5 ml磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline, PBS）离心管中，并且转移到实验室，在低温下进行分离培养。经术后病理检查，患者的子宫内膜都没有发生病变，获取子宫内膜样本及所需操作均在术前取得患者同意。

1.2 主要试剂及仪器

D-MEM/F-12培养基及胶原酶I（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），培养皿、培养瓶以及多孔板等（Corning公司）；倒置显微镜（Leica公司，DMi1），400目不锈钢筛网（博理医疗仪器有限公司），立可灵一次性宫腔组织吸引管（上海家宝医学保健科技有限公司，C3.1型），二氧化碳（CO2）细胞培养箱（Thermo公司，3429型），低速离心机（北京医用离心机厂，DT5-1B）；小鼠抗人波形蛋白单抗、小鼠抗人角蛋白单抗、即用型链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex method, SABC）免疫组化染色试剂盒和二氨基联苯胺3（3'-diaminobenzidine, DAB）（武汉博士德公司）。

1.3 方法

1.3.1 子宫内膜腺上皮及间质细胞的分离及培养 ①在无菌操作的条件下，使用PBS液清洗子宫内膜，共计3次；除去血块及黏液，将子宫内膜组织剪成大小约为0.5～1.0 mm3碎块。②加入2.5～5.0 倍体积的0.1%胶原酶I，混匀37℃水浴60～120 min（EMs组标本120 min，正常组标本60～90 min）。③经步骤②处理后，使用规格为38 mm的过滤网进行过滤，并且把滤液以1 000 r/min的速度进行离心，时长为5 min。经离心处理后，摒弃上层清液，下层的沉淀主要成分为间质细胞；把过滤网上残留的物质进行漂洗并收集，然后进行离心处理，摒弃上层清液，下层的沉淀主要成分为腺上皮细胞团。④ 使用细胞计数器进行细胞计数后，将混有间质细胞的沉淀液以5×105/ml接种于加有培养液的培养瓶内。再将混有腺上皮细胞团的沉淀液以400 个 / cm2接种于加有培养液的培养瓶内。⑤EMs组间质细胞标本在培养瓶中培养30 min，正常组间质细胞标本在培养瓶中培养45～60 min之后，摒弃悬浮在上方的腺上皮细胞和细胞，再次分别将培养液加入其中。⑥正常组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养120～150 min，EMs组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养90～120 min，之后吸出悬浮在上层的腺上皮细胞团和细胞，并且将其转移到加有培养液的新培养瓶中或直接种到6孔板及24孔板中。⑦置于CO2体积分数为5%并且温度为37℃的孵箱中进行培养，培养1 d后更换培养液，之后每隔2、3 d再更换1次。

正常组子宫内膜腺上皮及间质细胞分离培养主要参照唐雪莲[2]的方法，本实验中对EMs组子宫内膜腺上皮及间质细胞分离培养进行了如下改良：相比正常组，延长EMs组消化时间30～60 min（步骤②），缩短了其后的贴壁等待时间约15～30 min（步骤⑤、⑥）。

1.3.2 子宫内膜腺上皮及间质细胞的形态与纯度鉴定 ①将细胞置于倒置显微镜下，观察上述细胞的形态学差异。②用小鼠抗人波形蛋白单抗、小鼠抗人角蛋白单抗对腺上皮细胞及间质细胞分别进行免疫染色，操作按照说明书进行。其中小鼠抗人波形蛋白单抗、小鼠抗人角蛋白单抗的工作浓度均为1∶100。

1.3.3 子宫内膜腺上皮及间质细胞的传代 原代细胞铺满瓶底后，进行传代，向瓶内加入0.125%胰酶加0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA），室温下消化2 min，加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养基终止反应。用吸管将细胞自瓶底吹下并使其呈均匀混悬液。将细胞悬液以1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培养基，将细胞吹匀，按1传3的比例进行传代培养。

2 结果

2.1 细胞培养结果

12例子宫内膜标本中10例培养成功，2例培养失败。其中，1例是因为细菌污染所致，1例是因为细胞量过少所致。经原代培养的子宫内膜细胞，在接种1 d之后，基本能贴壁。接种4～7 d，腺上皮细胞铺满；接种3～7 d间质细胞铺满，细胞存活率≥90%。

2.2 对间质细胞培养过程的观察

EMs组间质细胞贴壁较快，约15 min后开始逐渐贴壁；正常组约30 min后开始贴壁，2 h后大部分贴壁；EMs组和正常组子宫内膜间质细胞在体外生长时外观特征相似。两组间质细胞均呈梭形，纺锤状，折光性强，胞质薄而透明，核椭圆，长期培养后细胞延伸为长梭形，相互平行排列成束。两组原代培养的间质细胞纯度相当高，几乎见不到腺上皮细胞团，偶见的小团样生长腺上皮细胞经传代1、2代亦可去除纯化。间质细胞易被传代，生存期长，10代以内其形态基本不变。

2.3 对腺上皮细胞培养过程的观察

EMs组腺上皮细胞团贴壁较快，约90 min后开始逐渐贴壁；正常组约2 h后开始贴壁，24 h后均贴壁良好。EMs组和正常组子宫内膜腺上皮细胞在体外生长时外观特征相似。两组腺上皮细胞胞质饱满，核大圆，核仁明显，细胞多数形态为星形、多角形，形状不规则，呈旋涡状成团生长。腺上皮细胞团中偶见间质细胞插入性生长，较散在。培养瓶中腺上皮细胞约占细胞总数92%～98%。两组腺上皮细胞均能传1、2代，传代后细胞数量逐渐减少。

2.4 消化时间及贴壁时间不同对两组细胞生长的影响

本实验发现在使用胶原酶I消化两组细胞时，正常组标本消化60～90 min，正常组的子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞可以达到较好的分离效果，但是，如果采用与正常组相同的消化时间EMs组只能得到数量很少的腺上皮和间质细胞（少于正常组的30%）。考虑消化时间不够，延长EMs组标本消化120 min后，间质细胞及腺上皮细胞纯度增加。

正常组间质细胞标本在培养瓶中培养45～60 min之后，间质细胞纯度较高。如果采用与正常组相同的贴壁时间，EMs组只能得到纯度较低的间质细胞（混有较多的腺上皮细胞）。考虑贴壁时间较长，一部分腺上皮也已贴壁。故减少培养时间，EMs组间质细胞标本在培养瓶中培养30 min之后，间质细胞纯度明显提高。

正常组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养120～150 min之后，间质细胞基本全部贴壁，悬浮液中腺上皮纯度较高。如果采用与正常组相同的贴壁时间，EMs组只能得到数量很少的腺上皮细胞。考虑贴壁时间较长，大部分腺上皮细胞也已贴壁，悬浮液中腺上皮细胞剩余较少。故减少培养时间，EMs组腺上皮细胞标本在培养瓶中培养90～120 min，腺上皮细胞数量明显提高。

2.5 细胞纯度鉴定

对EMs组子宫内膜细胞使用改进后的分离培养方法后，分别取得EMs组间质细胞及腺上皮细胞原代细胞。用对腺上皮细胞特异的细胞角蛋白单克隆抗体标记腺上皮细胞，对间质细胞特异的波形蛋白单克隆抗体标记间质细胞，原代培养的EMs组腺上皮细胞角蛋白染色阳性，纯度率约95%；原代培养的EMs组间质细胞行波形蛋白染色呈阳性反应，细胞纯度率可达97%以上。

3 讨论

子宫内膜细胞的原代培养，其生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传物性。体外原代培养EMs患者的在位以及异位子宫内膜细胞，能够将细胞在组织原位信息，当作是研究子宫内膜细胞的代谢、分化以及生长的实验模型，能够为异位症的临床研究与治疗提供依据。根据经血逆流致病学说，发生EMs的组织是子宫内膜。有学者指出，体外培养子宫内膜细胞，实际上是模拟EMs[3]。经研究证实，对子宫异位患者的内膜进行体外培养，内膜细胞的生化活性以及内膜细胞和在为内膜细胞的相似；和异位子宫的内膜细胞相比较，在为子宫的内膜细胞更容易获取足够的标本量，所以，利用EMs患者在位子宫的内膜进行分离培养，所得到的间质细胞和腺上皮细胞可以当做EMs的体外模型。

关于子宫内膜间质及腺上皮细胞的分离培养有较多文献报道[4-7]，但子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞培养参考文献不多[8]，并且未检索到比较正常子宫内膜和子宫内膜异位症在位子宫内膜分离培养方法差异的文献。在现有关于子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞培养的报道中，细胞纯度尤其是腺上皮细胞纯度不高[9-12]。虽然谭先杰等[13]报道的方法分离两种细胞纯度较高，但操作步骤复杂，4次筛网分离及用牛血清白蛋白梯度离心的方法增加了污染的可能性。李傲等[14]报道将胶原酶的浓度提高，用量加大，可提高两类细胞的产量。这里笔者参考唐雪莲等[2]的子宫内膜简易分离法并加以改进。在实验中笔者发现EMs组子宫内膜消化时间需长于正常组，同时前者两种细胞贴壁均快于后者。Klemmt等[15]也发现EMs患者在位及异位子宫内膜较正常子宫内膜的黏附能力增加。在同样的处理时间60～90 min下相比正常组，EMs组用胶原酶消化不够完全，仍然有较大的组织块存在，增加后续的分离困难。而当延长消化时间至120 min后，内膜组织消化较完全。EMs组分离间质细胞时，若采用正常组的贴壁时间45～60 min因已有部分腺上皮细胞贴壁而致纯度下降；分离腺上皮细胞时，若采用正常组的贴壁时间120～150 min因腺上皮细胞贴壁快而在之后的上清液中所剩无几，故笔者采取了延长EMs组的消化时间（较正常组长30～60 min），并减少其后的贴壁等待时间（较正常组减少15～30 min），使尽可能少的腺上皮细胞贴壁而纯化间质细胞；多放培养皿增加接触面积，使在较短贴壁时间内（较正常组减少30～60 min）尽可能多的间质细胞贴壁和尽可能少的腺上皮细胞贴壁从而获得尽可能多的腺上皮细胞。分离过程简便，按不同贴壁时间分离获得的EMs组和正常组的腺上皮和间质细胞纯度及活性均高，可作为子宫内膜异位症在位子宫内膜细胞常规培养方法的改进。

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