下调FoxM1基因表达对肾癌786-O细胞生物学行为的影响

程鑫宇，吴小荣，贾博深，沙建军，陈勇辉，黄吉炜，张进，刘东明，黄翼然(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200001)

下调FoxM1基因表达对肾癌786-O细胞生物学行为的影响

程鑫宇，吴小荣，贾博深，沙建军，陈勇辉，黄吉炜，张进，刘东明，黄翼然
(上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200001)

摘要:目的观察下调肾癌786-O细胞中叉头框转录因子M1( FoxM1)基因的表达对肾癌细胞生物学行为的影响。方法采用FoxM1的干扰序列和短发夹RNA( shRNA)构建shFoxM1质粒。将786-O细胞分为shFoxM1组与对照组，分别转染shFoxM1、scramble质粒48 h。分别用Real-time PCR、Western blot法检测细胞FoxM1 mRNA及蛋白，平板克隆形成实验观察1周细胞克隆形成率，采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率，Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力，MTT法检测细胞培养0、24、48、72 h时的细胞吸光度值。结果与对照组比较，shFoxM1组FoxM1 mRNA和蛋白表达减少，细胞克隆形成率、细胞吸光度值降底，G1期细胞比例增加而G2、S期减少，早期凋亡率增加，迁移、侵袭的穿膜细胞减少，P均＜0.05。结论下调FoxM1基因表达，可抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移、侵袭能力，使细胞阻滞于G1期，促进细胞的早期凋亡。

关键词:叉头框转录因子M1;肾肿瘤;透明细胞癌;细胞增殖;细胞凋亡;核糖核酸干扰技术

Effect of down-regulating FoxM1 expression on biological behavior of renal cancer 786-O cells

CHENG Xin-yu，WU Xiao-rong，JIA Bo-shen，SHA Jian-jun，CHEN Yong-hui，HUANG Ji-wei，ZHANG Jin，LIU Dong-ming，HUANG Yi-ran
( Renji Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200001，China)

Abstract:Objective To observe the down-regulation of forkhead box protein M1 ( FoxM1) gene expression and to investigate its effect on the biological behavior of human renal cancer cell line 786-O.Methods The shFoxM1 plasmid was constructed by RNA interference sequence and shRNA.786-O cells were divided into the shFoxM1 group and the control group which were transfected with shFoxM1 plasmid and scramble plasmid for 48 h，respectively.The expression of FoxM1 mRNA and protein was tested by real-time PCR and Western blotting.Then we analyzed the efficiency of plate colony formation in one week by using colony formation assay，and we used flow cytometry to detect the cell cycle and apoptosis of 786-O cells.The migration and invasion abilities were analyzed by Transwell assay，and the OD value in 0，24，48 and 72 hours was tested using MTT assay to analyze the activity of proliferation.Results Compared with the control group，the FoxM1 mRNA and protein expression was decreased，the efficiency of plate colony formation and the cell proliferation were decreased，the cells were blocked in G1phase，cells of G2phase and S phase reduced，the early apoptosis rate rose and the migration and invasion cells were decreased in the shFoxM1 group ( all P＜0.05).Conclusions Down-regulating FoxM1 gene expression suppressed the proliferation，migration and invasion abilities of 786-O cells，blocking cells in G1phase and promoting early apoptosis.

Key words:forkhead box protein M1; kidney neoplasms; clear cell carcinoma; cell proliferation; apoptosis; RNA interference technology

肾癌是常见的泌尿系统肿瘤，近年来发病率和病死率持续上升［1，2］，肾透明细胞癌( ccRCC)是其主要病理类型［3］。叉头框转录因子M1( FoxM1)是一种增殖性转录因子，与多种肿瘤的发生、发展密切相关［4，5］;其可通过对多种靶蛋白的转录激活作用影响肿瘤细胞的生物学行为，如细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等［6］。2015年1～4月，我们构建了靶向FoxM1基因的短发夹RNA( shRNA)，并将其转染人肾癌786-O细胞，观察下调FoxM1表达对肾癌细胞生物学行为的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料人ccRCC细胞株786-O为仁济医院泌尿外科自有;转染试剂X-tremeGENE HP( Roche，Switzerland) ; Opti-MEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清( FBS)、胰酶、TRIzol ( Life technologies，USA) ;逆转录试剂盒、SYBR Green I kit ( TaKaRa，Japan) ;兔抗人FoxM1抗体( Santa Cruz，USA) ;二甲基亚砜( DMSO)、牛血清白蛋白( BSA) ;四甲基偶氮唑盐( MTT)、碘化丙啶( PI)、鼠抗人GAPDH抗体( Sigma-Aldrich，USA) ;辣根过氧化物酶( HRP)标记的抗兔、抗鼠二抗( DAKO，USA) ;总蛋白提取试剂盒(碧云天，中国) ; Matrigel胶、Transwell小室及Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒( BD，USA) ;限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶( NEB，USA) ; pRFP-C-RS质粒、scramble质粒( OriGene，USA)。

1.2 shFoxM1构建根据Genbank设计针对FoxM1的干扰序列，由Invitrogen中国公司合成，经Blast检测不与其他人类基因互补;颈环结构为TCAAGAG，5'及3'端引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点;正义链为5'-GATCGCTTGCAGCCAATCGTTCTCT GACAGAAGGTCAAGAGGAACGTCGGTTAGCAAGAGACTGTCTTCCTTTTTTGA-3'，反义链为5'-AGCTTCAAAAAACTTGCAGCCAATCGTTCTCTGACAGAAGGCTCTTGAGAACGTCGGTTAGCAAGAGACTGTCTTCCC-3'，经上海铂尚生物技术有限公司测序证实。

1.3细胞分组与转染将786-O细胞于含10% FBS的RPMI-1640培养基中培养，分为shFoxM1组、对照组，每组约5×106个细胞。待各组细胞生长融合至70%时，将shFoxM1组、对照组按照X-tremeGENE HP说明书［7］分别转染shFoxM1、scramble质粒(阴性对照)，转染后将细胞置于含10% FBS的RPMI-1640培养基，于37℃恒温细胞培养箱培养48 h。以荧光显微镜下观察到＞15%的细胞被红色荧光标记，为转染成功。

1.4相关指标观察

1.4.1 FoxM1 mRNA表达检测采用Real-time PCR法。根据PrimerBank设计FoxM1基因PCR引物，由上海铂尚生物技术公司合成。FoxM1上游引物: 5'-GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3'，下游引物: 5'-GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3'; GAPDH:上游引物5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引物5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反应条件: 95℃10 min，95℃15 s，60℃退火1 min，共40个循环。采用相对定量法计算2－ΔΔCt值，以此表示FoxM1 mRNA相对表达量。

1.4.2 FoxM1蛋白表达检测采用Western blot法，检测各组FoxM1蛋白表达。所有操作均严格按照使用说明书进行，实验重复3次，以目的蛋白与β-actin电泳条带吸光度比值表示FoxM1蛋白表达量。

1.4.3细胞增殖观察采用MTT法。取各组细胞以2×103/孔接种于96孔板培养，每组12个复孔。于培养0、24、48、72 h时各取3个复孔，弃去原培养液后每孔加入含0.5 mg/mL MTT的新鲜培养液100 μL，37℃孵育4 h ;吸去培养液，加入DMSO 100 μL/孔，摇床轻摇15 min;待紫色结晶充分溶解后，在酶标仪上570 nm处测量并记录每孔吸光度值，取每组平均值。

1.4.4细胞克隆形成观察取各组细胞，胰酶消化后充分吹打至细胞分散;接种于6孔板中，5× 102/孔;每组3个复孔，置于37℃含5% CO2的恒温细胞培养箱中培养1周。用70%乙醇固定，0.5%结晶紫染色10 min;将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，肉眼计数各孔克隆数目，取平均值。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%。

1.4.5细胞周期和凋亡观察①细胞周期检测:取各组细胞，70%乙醇4℃固定30 min; PBS洗涤，用500 μL PBS重悬;加入2.5 mg/mL PI 10 μL及1 mg/mL RNA酶10 μL，37℃培养箱孵育30 min;上BD FACS calibur流式细胞仪，测算G1期、G2期和S期细胞比例。②细胞凋亡检测:取各组细胞，重悬后室温避光条件下分别予Annexin V/FITC及PI染色15 min;上BD FACS calibur流式细胞仪，计算早期及晚期细胞凋亡率并取平均值。

1.4.6细胞迁移及侵袭观察取各组细胞，经无血清RMPI-1640培养基饥饿处理2 h;用含0.1% BSA的无血清RMPI-1640培养基重悬，至细胞密度为1× 106/mL(迁移)或5×105/mL(侵袭)。将Transwell小室置于24孔板中，完成基底胶包被过程(迁移实验无

需此步骤) ;上室加200 μL细胞悬液，下室加500 μL 含10%FBS的新鲜培养基，放于培养箱中培养。6 h后取出小室，棉签擦掉上室面细胞; PBS轻洗2遍，倒置风干;70%乙醇固定，0.1%( w/v)结晶紫染下室面15 min，PBS轻洗1遍后风干。显微镜下计数5个视野的细胞，以平均数表示迁移或侵袭能力。

1.5统计学方法采用SPSS18.0统计软件。计量资料以珋x±s表示，组间比较采用单因素方差分析及t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1两组FoxM1 mRNA及蛋白表达比较见表1。

表1　两组FoxM1 mRNA及蛋白表达比较(±s)

表1　两组FoxM1 mRNA及蛋白表达比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05。

组别FoxM1 mRNA 蛋白shFoxM1组　20.57±5.35*　25.33±5.60*对照组100.00±6.48　100.00±7.37

2.2两组细胞增殖情况比较见表2。

表2　两组细胞增殖情况比较(±s)

表2　两组细胞增殖情况比较(±s)

注:与对照组同时点比较，*P＜0.05。

组别吸光度值0 h　24 h　48 h　72 h shFoxM1组　0.20±0.01 0.23±0.04 0.28±0.06*0.45±0.04*对照组0.20±0.04 0.25±0.01 0.39±0.05 0.62±0.03

2.3两组细胞克隆形成率比较接种后1周时，shFoxM1组、对照组细胞克隆形成率分别为7%、18%，P＜0.05。

2.4两组细胞周期和凋亡率比较见表3。

2.5两组细胞迁移及侵袭情况比较迁移实验中shFoxM1组、对照组穿膜细胞分别为( 240.67± 96.32)、( 989.33±100.47)个，P＜0.05;侵袭实验中shFoxM1组、对照组穿膜细胞分别为( 20.30± 7.41)、( 83.00±5.86)个，P＜0.05。

表3　两组细胞周期和凋亡率比较( %，±s)

表3　两组细胞周期和凋亡率比较( %，±s)

注:与对照组同时点比较，*P＜0.05。

组别细胞周期G1期　G2期　S期凋亡率早期　　晚期shFoxM1组　47.94±3.23*　2.76±1.43*　49.30±2.98*　12.33±1.50*9.29±2.00对照组　34.16±3.34　8.96±4.33　56.88±2.56　1.40±0.50　8.35±1.10

3　讨论

肾癌占全身恶性肿瘤的2%～3%［8］，根治性手术为其主要治疗方法;但早期局限性肾癌术后仍有30%可能发生远处转移［9］，预后较差。肾癌对放疗、化疗及免疫治疗均不敏感，治疗有效率＜20%［10］。

FoxM1是一类增殖性转录因子，广泛表达于哺乳动物组织中，与细胞增殖、更新、分化、迁移、有丝分裂及DNA损伤修复等［11］多种细胞生物学功能密切相关。其在肝癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤中高表达。全基因组分析显示，其可能是恶性肿瘤中表达上调频率最高的基因之一［12］，且肿瘤发生早期即出现高表达［13］，提示其可能是促使肿瘤发生及进展的关键因子之一。我们前期研究显示，与正常肾组织相比，肾癌组织中FoxM1蛋白表达明显增高，且与患者预后有关，提示其可能与肾癌发生、发展有密切关联［14］。

Janus等［15］研究发现，对有丝分裂过程中纺锤体正确装配起重要作用的中心体蛋白CEP55可能是FoxM1下游靶基因，可能是FoxM1促进肿瘤细胞增殖的机制之一。本研究发现，使用shRNA下调FoxM1表达可明显抑制786-O细胞的增殖能力及克隆形成能力。说明FoxM1是促进肾癌细胞增殖的重要因子之一，其机制可能与FoxM1促进增殖相关细胞因子的转录有关。本研究同时发现，shFoxM1组处于G1期细胞比例明显增加，S期及G2期细胞比例减少，说明抑制FoxM1的表达可使786-O细胞发生G1期阻滞。FoxM1作为重要的转录因子，可调控Cyclin D1、Cyclin B1等周期相关因子的转录;抑制FoxM1表达后下调相关因子水平，从而阻断正常细胞周期。同时，流式细胞术检测表明抑制FoxM1表达可明显促进凋亡特别是早期凋亡，提示FoxM1在肾癌细胞中具有抗凋亡作用。有研究表明，干扰FoxM1表达后，Caspase-3活化增多［16］; Kalin等［17］发现，干扰前列腺癌细胞中FoxM1表达，可下调Bcl-2表达。因此，FoxM1可能通过参与对细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3等多种凋亡相关分子的转录调控发挥其抗凋亡作用。Wang等［18］研究表明，FoxM1可通过调控c-Jun氨基末端激酶1的转录促进细胞侵袭，从而促进肿瘤进展。说明FoxM1不仅在细胞增殖中具有重要作用，同时也参与了肿瘤侵袭转移过程的调控。基质金属蛋白酶家族( MMPs)可通过降解细胞外基质成分，在肿瘤侵袭及转移过程中扮演关键角色，且在多种肿瘤组织中高表达［19］。FoxM1可激活MMPs成员如MMP2、MMP9表达，Wang等［20］研究表明，FoxM1B转基因小鼠中，MMP9呈过表达。Kong等［21］研究表明，在肺癌细胞中过表达

FoxM1可增强TGF-b1诱导的上皮间质转化能力，而EMT可促进肿瘤细胞浸润及肿瘤转移，敲除FoxM1则可逆转其EMT作用。本研究结果显示，抑制FoxM1表达后786-O细胞迁移能力与侵袭能力均明显降低，可能与FoxM1对MMPs的激活作用及促使细胞表达间质细胞标志物从而增强EMT作用有关，具体机制有待于进一步研究。综上所述，FoxM1的表达与肾癌细胞的生物学行为密切相关，有望成为肾癌治疗的新靶点。

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收稿日期:( 2015-04-12)

通信作者简介:刘东明( 1961-)，男，硕士，主任医师，教授，硕士生导师，研究方向为肾癌的基础与临床。E-mail: liudm541@126.com

作者简介:第一程鑫宇( 1990-)，男，硕士，研究方向为泌尿系统肿瘤的基础与临床。E-mail: jobberknoll90@163.com

基金项目:国家自然科学基金资助项目( 81402084) ;上海市卫生局课题资助项目( 2012206)。

文章编号:1002-266X( 2015) 30-0001-04

文献标志码:A

中图分类号:R737.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.30.001