固相萃取-UPLC-MS/MS法建立大鼠血浆中蒜氨酸含量测定方法

固相萃取-UPLC-MS/MS法建立大鼠血浆中蒜氨酸含量测定方法

李博， 李新霞

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐830011)

摘要：目的建立基于UPLC-MS/MS与固相萃取(SPE)相结合的大鼠血浆中蒜氨酸的分析方法。方法用强阳离子基质的SPE柱提取大鼠血浆中的蒜氨酸和降低基质效应，UPLC-MS/MS法进行测定。结果对SPE方法中淋洗液和洗脱液进行优化，选择水为淋洗液，甲醇-氨水(95∶5)为洗脱液，回收率>68%；蒜氨酸的标准曲线相关系数r2>0.99；蒜氨酸测定的日内精密度和日间精密度良好，相对标准偏差(RSD%)分别低于2.1和8.2。结论本方法可有效降低复杂生物样品中的基质效应，测定方法准确、可靠，具有很好的应用前景。

关键词：蒜氨酸； 固相萃取； UPLC-MS/MS

中图分类号：R914文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.014

[收稿日期：2014-10-8]

基金项目：新疆维吾尔自治区科技计划项目 (201130105-2)

作者简介：王艳(1980-)，女，副教授，博士，研究方向：新疆地方药用植物的研究。

作者简介：热娜˙卡斯木女,女(维吾尔族)，博士，教授，博士生导师，研究方向：新疆特色中药资源的开发与利用研究，E-mail:renakasimu@vip.sina.com。

Solid phase extraction-UPLC-MS/MS method to establish the determination

method of alliin content in rat plasma

LI Bo, LI Xinxia

(CollegeofFarmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

Abstract：ObjectiveTo establish an analysis method of alliin in rat plasma based on UPLC/MS/MS in combination with solid phase extraction (SPE). MethodsSPE column (strong) cationic matrix was used to extract alliin in rat plasma and to reduce the matrix effect, with UPLC/MS/MS method for determination. ResultsOptimize the eluent in SPE method and choose water as eluent, methanol-ammonia (95:5) as the eluent, with the recovery rate above 68%, the correlation coefficient of Alliin standard curve r2>0.99, good inter-and intra -day precision for the alliin determination, and the relative standard deviation (RSD) less than 2.07 and 2.07 respectively. ConclusionThis method is effective in reducing the matrix effect of complex biological samples, with accuracy, reliability and good application prospects.

Key words： Alliin； SPE； UPLC/MS/MS

大蒜(Allium sativum L．)为百合科葱属多年生草本植物，产于世界各地，富含大量的生物活性物质和营养成分，是公认的药食两用珍品[1]。现代医学证明，大蒜具有杀菌、降血脂、抗血栓、预防中风和高血压、保护肝脏、提高机体免疫力及抗癌等功能[2-3]。大蒜中的功效成分是蒜酶催化裂解蒜氨酸的产物，了解蒜氨酸在血液等生物样品中的处置决定了大蒜的活性制剂的合理科学应用。本课题组在蒜氨酸测定方面相关研究已有很多年，在提取、分离、纯化、制剂及分析方法等方面均取得了一定的成果[4-7]。建立合适的测定生物样品中蒜氨酸的方法显得尤为重要。

近年来，利用可挥发性的离子对试剂，快速、简便、灵敏的超高效液相色谱-电喷雾串联质谱(UPLC-ESI MS/MS)方法已用于复杂生物基质(血浆或尿液)样品的测定。与传统的分析方法相比，UPLC-ESI MS/MS技术具有高特异性、高灵敏度和高通量的优势[8-9]。由于质谱检测的高选择性，基质效应的影响在色谱图上往往观察不到，即空白基质色谱图表现为一条直线，但这些共流出组分会改变待测物的离子化效率，引起待测物检测信号的抑制或提高，影响分析结果的重现性和准确性。固相萃取(SPE)能够有效降低基质效应，尤其在测定低含量物质时还具有预浓缩样品待测成分的优势[9]。

本研究建立UPLC-MS/MS方法用于分析血浆中的蒜氨酸,并使用强阳离子交换固相萃取柱提取血浆中的氨基酸和降低基质效应，对分析方法的回收率、线性、精密度和准确度进行考察。

1试药与仪器

1.1药品蒜氨酸对照品(GSB11-3079-2013，新疆埃乐欣药业有限公司，批号：AL080430，含量≥99%)。

1.2试剂与仪器甲醇(色谱纯,Fisher)，乙腈(色谱纯,Fisher)，盐酸(分析纯,西安化学试剂厂)， 甲酸(分析纯,天津富宇精细化工)， 乙酸铵(分析纯,上海试四赫维化工)。WatersOasis@MCX小柱(Waters)，固相萃取仪(Waters)， WatersAcQuity超高效液相(Waters)， 质谱Xevo TQ(Waters)。

2方法与结果

2.1溶液配置

2.1.1血浆的制备大鼠用乙醚麻醉，腹腔静脉采血，肝素锂抗凝，3 000 r/min离心10 min，取血浆。

2.1.2蒜氨酸对照品溶液的制备精密称取蒜氨酸对照品10.10 mg于10 mL容量瓶中，水溶解并定容至刻度，摇匀，即得蒜氨酸对照品储备溶液(C=1 010.0 μg/mL)。用水进行倍比稀释，得浓度分别为30.30、25.25、20.20、15.15、10.10、3.30、0.51 μg/mL蒜氨酸对照品溶液，用于标准曲线的绘制。

2.2血浆样品的处理

2.2.1SPE预处理依次用1 mL甲醇和1 mL 2%甲酸溶液(pH 2)活化并平衡固相萃取小柱。

2.2.2供试品溶液制备取待处理样品溶液300 μL，上样，用水3 mL淋洗，保持正压直至SPE柱床材料完全干燥；用1 mL的体积比为5/95的氨水-甲醇溶液分次洗脱；洗脱液以氮气吹干，水复溶，上活化好的SPE柱，分别以水3 mL淋洗，吹干，以1 mL5%氨水-甲醇溶液洗脱，氮气吹干，水定容至5 mL。

2.3血浆中蒜氨酸UPLC-MS-MS色谱分析方法建立色谱质谱条件：色谱柱：Spursil C18 (100 mm×2.1 mm，3 μm)；流动相：0.1%甲酸-甲醇(95∶5)；流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；进样量：5 μL。质谱条件：电喷雾正离子化(ESl)；毛细管电压电压1 000 V；毛细管温度400℃；锥孔电压：16 V；碰撞电压：13 V；碰撞气为氩气，检测模式为多反应监测(MRM)。专属性试验：分别取空白血浆、血浆中提取的蒜氨酸、蒜氨酸对照品，记录色谱图(图1～5)。

图1蒜氨酸对照水溶液色谱图及总离子流

图2蒜氨酸对照水溶液质谱图Parent Ions

图3蒜氨酸对照水溶液质谱图Daughter Ions

图4空白血浆总离子流图

在所采用的色谱条件下，蒜氨酸峰形良好，无杂质干扰峰影响测定。根据蒜氨酸断裂的模式及机理选择血浆中蒜氨酸的定性和定量离子对，选定正离子模式用于蒜氨酸的分析以获得较高的灵敏度。将蒜氨酸标准溶液直接注入质谱进行产物离子扫描，获得其产物离子(或碎片离子)，产物离子与文献比较一致。m/z为177.8/160.8时灵敏度最高，选定血浆中蒜氨酸的定量离子对。

2.3.1线性与范围

2.3.1.1水溶液中蒜氨酸的线性考察将“2.1.2”项下蒜氨酸对照品溶液，制成一系列不同浓度的蒜氨酸标准溶液，UPLC-MS-MS法测定蒜氨酸，以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性回归，得回归方程Y=7 250X-1 622.2(r=0.998 3)，表明蒜氨酸在0.101～30.30 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

图5　血浆中提取的蒜氨酸总离子流图

2.3.1.2血浆中蒜氨酸线性关系考察取“2.1.1”项下制备的血浆100 μL，加蒜氨酸对照储备液，制成一系列不同浓度蒜氨酸的血浆溶液，分别加水100 μL ，照“2.2”项下方法制备，UPLC-MS-MS法测定，以峰面积(Y)对进样浓度(X)进行线性回归，得回归方程Y=5 247X-957.7(r= 0.999 0)，表明蒜氨酸在1.52～30.30 μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.2定量限与检测限取蒜氨酸对照品贮备液逐级稀释后，按照上述色谱条件进样测定，以S/N=10，测得蒜氨酸定量限为100 ng/mL；以S/N=3，测得蒜氨酸检测限为10 ng/mL。

2.3.3精密度试验取“2.3.1.2”项下制备的3.03、10.10、30.30 μg /mL 3种浓度蒜氨酸血浆提取溶液，分别进样5 μL，日内连续测定5次，考察日内精密度，连续测定5 d，考察日间精密度，得到低、中、高浓度的血浆提取样品日内RSD%分别为2.0、2.1和1.9；低、中、高浓度的血浆提取样品日间RSD%分别为7.5、3.0和8.2，对于复杂的生物样品来说日内及日间精密度均良好。

2.3.4提取回收率及基质效应考察

2.3.4.1提取回收率试验分别精密取150、500、1 000 μg/mL的蒜氨酸标准溶液各100 μL于eppendorf离心管中，再分别加入100 μL大鼠血浆，加水100 μL，涡旋混合均匀。照“2.2”项下方法制备，测定，与相应浓度蒜氨酸标准水溶液计算。结果表明上述提取方法蒜氨酸的回收率>63%，考虑到对于蒜氨酸的蛋白结合情况及血浆样品的复杂性，回收率结果满意。

2.3.4.2基质效应考察取“2.1.1”项下血浆,照“2.2”项下方法制备至吹干后，分别加入150、500、1 000 μg/mL的蒜氨酸标准溶液各100 μL，加水定容至5 mL，测定，与相应浓度蒜氨酸标准水溶液计算。结果在3个浓度水平的基质回收率>95%，基本消除信号抑制现象。

3结论

本研究采用MCX-SPE的提取方法代替传统的直接上样的方法，方法简单，回收率较好，重现性好，有效地降低了复杂生物样品中的基质效应。 UPLC-ESI MS/MS法测定蒜氨酸含量与传统的分析方法相比有较高特异性、灵敏度，具有重要的应用前景。本课题组今后还将对其他生物样品(如肠吸收液、细胞提取液等)中的蒜氨酸提取进行考察。本方法的建立对今后蒜氨酸的生物代谢研究提供了检测方法。

参考文献:

[1]Makoto I, Nagatoshi I, Jiro Y,et al. Determination of Organosulfur Compounds in Garlic by High-Performance Liquid Chromatography[J]. J Agric Food Chen, 2006, 54:1535-1540.

[2]Uchida Y, Takahasbi T, Sato N.The characteristics of the antibacterial activity of garlic[J]. Jpn J Antibiot, 1975,28(4):638-642.

[3]Song K, Milner JA. Fleating garlic inhibits its ability to suppress 7, 12-dimethyl benz (a) anthracene-induced DNA adduct formation in rat mammary tissue[J]. J Nutr, 1999, 129(3):657-661.

[4]王岩，李新霞，陈坚．薄层扫描法测定大蒜中蒜氨酸的含量[J]．中国药学杂质,2003,38(3)：217-218.

[5]常军民，张丽静，美丽万．HPLC测定不同产地大蒜中蒜氨酸的含量[J]．中成药,2004,26(12)：1025-1027.

[6]赵荣梅.鲜蒜、蒜氨酸、蒜酶定量分析方法与蒜氨酸质量标准研究[D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2008：1-7.

[7]袁耀佐, 杭太俊, 纪宇, 等. 柱前衍生化反相高效液相色谱法测定大蒜中的蒜氨酸及其有关物质[J]. 色谱, 2008, 26(2):242-245.

[8]van Eeckhaut A，Lanckmans K，Sarre S，et al．Validation of bioanalytical LC-MS/MS assays:evaluation of matrix effects[J].J Chromatogr B，2009，877(23)：2198.

[9]汤新星，顾源，蔡尚 等. 固相萃取-高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术分析大鼠血浆中的氨基酸及其在电离辐射损伤动物模型中的应用[J].色谱,2012,30(7):696-704.

(本文编辑施洋)