气相色谱—质谱法测定肉制品中的9种挥发性N—亚硝胺类物质

何淑娟等

摘 要：研究建立一种适用于肉制品中9 种挥发性N-亚硝胺含量的气质联用快速检测方法。实验优化提取溶剂和色谱柱对提取和分离检测影响的条件，同时考察4 种固相萃取单柱（酸性氧化铝、C18、活性炭、PSA）和1种双填料的混合固相萃取柱（PSA-C18）的净化效果。结果表明：本检测方法的线性系数均可达到0.999 2以上；线性范围为0～10 μg/mL；重现性良好，相对标准方差均≤3.2%；回收率为85%～98%；检测限分别为N-亚硝基二甲基胺

1.0 μg/kg、N-亚硝基甲基乙基胺2.1 μg/kg、N-亚硝基二丁基胺0.8 μg/kg；其他均为0.5 μg/kg。该方法能够满足测定肉及肉制品中N-亚硝胺的残留含量的需要。

关键词：气质联用；肉制品；N-亚硝胺；固相萃取

Determination of Nine N-Nitrosocompounds in Meat Products by Gas Chromatograph-Mass Spectrometry

HE Shujuan， ZHAO Limin， LI Qiang， CAI Lipeng， ZHANG Yan*

（Hebei Institute of Food Quality Supervision Research， Shijiazhuang 050091， China）

Abstract： This research has established a rapid detection method for nine volatile N-nitrosamines in meat and meat products by using gas chromatograph-mass spectrometry （GC-MS）. In this experiment， we investigated the effect of extraction solvent type and chromatographic conditions on the extraction and separation of the target compounds. Meanwhile， comparison of solid-phase extraction （SPE） cartridges packed with acidic alumina， C18， activated carbon or PSA， or both C18 and PSA was carried out for the purification of the N-nitrosamines. Results showed that the linear range of the proposed method was

0?10 μg/mL with correlation coefficients more than 0.999 2. Good reproducibility was observed with relative standard deviation （RSD） not exceeding 3.2% and the mean recoveries were in the range of 85%?98%. The detection limits for N-nitrosodimethyl amine （NDMA）， N-nitrosomethyl ethyl amine （NMEA）， N-nitro sodibutyl amine （NDBA） and six other N-nitrosamines were 1.0， 2.1， 0.8 and 0.5 mg/kg， respectively. This method can meet the requirement for the determination of N-nitrosamine residues in meat and meat products.

Key words： gas chromatograph-mass spectrometry （GC-MS）； meat products； N-nitrosamines； solid phase extraction

中图分类号：TS254 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）01-0027-04

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201501007

亚硝酸盐在肉制品加工中起到很好的作用，不仅可以抑制梭状肉毒杆菌的生长繁殖和产生毒素，对典型腌肉风味的产生起重要作用，还具有抗氧化的效果。但是，亚硝酸盐在腌肉中可以转化为亚硝酸，很容易和次级胺类物质反应产生致癌性物N-亚硝胺类化合物。N-亚硝胺物质一般结构为R2（R1）N—N=O，食品中N-亚硝胺主要在食品加工和贮藏过程中形成，常见于腌制、烟熏、焙烤等制品中。N-亚硝胺类化合物不仅具有致畸性和致突变性，而且对神经和肾脏有害[1-8]。

目前用于检测食品中的亚硝胺的前处理方法有很多，包括水蒸气蒸馏法[9-10]、低温真空蒸馏法[11]、溶剂液液萃取法[12]及固相萃取法[13]等。由于肉类食品的基质复杂性和食品中亚硝胺逐渐下降的趋势[14-15]，因此合适的前处理提取方法对准确检测亚硝胺至关重要。

目前熟肉制品中N-亚硝胺物质的检测方法主要有气相色谱法[16]、液相色谱法[17]、气相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-串联质谱法、气相色谱-热能分析法等[18-21]。在

GB/T 5009.26—2003《食品中N-亚硝胺类的测定方法》中气相色谱-热能分析样品前处理复杂、耗时长、仪器方法成本高，实际可操作性不强。而气相色谱-质谱联用法（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）是最常见的检测N-亚硝胺物质的方法。本研究选择9种常见的挥发性亚硝胺，利用GC-MS的高效分离能力和高灵敏性建立了一种适用于肉制品的快速、准确的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熟制猪肉制品为市售。

N-亚硝基二甲基胺（NDMA）（纯度>99.9%） 美国Sigma公司；N-亚硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亚硝基二乙基胺（NDEA）、N-亚硝基吡咯烷（NDEA）、N-亚硝基吗啉（NDEA）、N-亚硝基二丙基胺（NDPA）、N-亚硝基哌啶（NPIP）、N-亚硝基二丁基胺（NDBA）、N-亚硝基二苯基（NDPhA）（纯度

均>98%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；二氯甲烷（色

谱纯） 美国J.T.Baker公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A/MS 5973i气相色谱-质谱联用仪（配

有电子轰击离子源（EI）） 美国Agilent 公司；HGB550高速组织捣碎机 美国Waring公司；K15高速冷冻离心机 美国Sigma公司；Visiprep DL固相萃取

装置 美国Supelco 公司；KQ5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司；数显型漩涡混合器 美国Talboys公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将熟肉制品切成小块，在组织捣碎机粉碎成匀浆或粉末状均匀样品。准确称取粉碎的熟肉样品20.0 g，置于50 mL具塞离心管中，加入30 mL二氯甲烷，涡旋振荡1 min，超声提取20 min，4 ℃条件下8 000 r/min离心10 min；吸取有机相层以20 mL二氯甲烷重复提取1次，合并2 次萃取相；将合并液放入100 mL鸡心瓶中，于40 ℃水浴中旋转蒸发至2 mL左右，待净化。

1.3.2 样品净化

用10 mL二氯甲烷活化固相萃取柱，将2 mL待净化样品转移至固相萃取柱，并用10 mL二氯甲烷分3 次洗脱固相萃取柱，收集所有洗脱液，于35 ℃鸡心瓶中旋转浓缩至近干，用1.0 mL二氯甲烷复溶，过0.22 μm有机膜，备用。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）；升温程序：40 ℃保持4 min；以5 ℃/min升至100 ℃，再以20 ℃/min升至250 ℃，保持2 min；进样口温度：250 ℃；载气（N2）流速1.5 mL/min；隔垫吹扫流量：3 mL/min；不分流进样；进样量：1.0 ?L。

1.3.4 质谱条件

电子轰击离子源（EI）；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度240 ℃；离子扫描模式。上述条件下，9 种N-亚硝胺类化合物的保留时间定性及定量离子如表1所示。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的优化

考察不同极性的气相色谱柱非极性柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）、中等极性柱DB-1701（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）、极性柱DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 ?m）对9 种待测N-亚硝胺类化合物分离的影响。结果表明，选用非极性柱HP-5MS时，

N-亚硝胺二甲基胺的色谱峰受溶剂峰影响大，且有色谱峰展宽的现象，峰形有拖尾现象；选用中等极性柱DB-1701时，仍有峰展宽的现象，而选用强极性柱DB-WAXETR时，获得的色谱峰峰形对称，分离度好。这是因为亚硝胺分子质量小，具有强极性和强挥发性，当使用强极性柱DB-WAXETR时有利于9 种物质很好的分离。因此，本实验选用DB-WAXETR作为色谱柱。

2.2 柱温升温速率的优化

N-亚硝胺类化合物的分子质量小、沸点低、出峰时间快，因此需要优化柱温的升温速率，以获得最佳的分离效果。选择柱温的起始温度为40 ℃，分别比较了升温速率为5 ℃/min和10 ℃/min时的分离效果，结果显示，当初期升温速率为10 ℃/min时，溶剂峰影响较大，且

N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉、N-亚硝基二丙基胺的色谱峰不能很好地分开；当升温速率为5 ℃/min时，9 种物质能够很好地分开，所以选择升温速率为5 ℃/min。当柱温升至100 ℃时，较难分离的N-亚硝基二丙基胺已经出峰，此时将升温速率提高至20 ℃/min，当柱温升高到250 ℃时，待测物均已出峰。在上述优化条件下，对9 种N-亚硝胺混合标准溶液进行分析，得到标准品的总离子流图见图1。

从左至右依此为N-亚硝基二甲基胺、N-亚硝基甲基乙基胺、N-亚硝基二乙基胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基吗啉N-亚硝基二丙基胺、N-亚硝基哌啶、N-亚硝基二丁基胺、N-亚硝基二苯基胺。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 样品提取方法的优化

水蒸气蒸馏法操作繁琐，耗时长，适用性不强，且操作温度高，易使被测物质亚硝胺损失。赵华[22]、吴燕燕[23]等采用超声振荡提取法提取水产品中的N-亚硝胺，样品添加回收率均在70%～105%，因此本研究采用超声振荡提取法对样品进行前处理。

本研究中9 种N-亚硝胺的极性不同，因此分别选用不同极性的二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、甲醇作为提取溶剂，结果表明，以二氯甲烷作为提取溶剂时目标物的回收率最高，正己烷次之。这是因为正己烷和二氯甲烷为亲油性，乙酸乙酯为亲油性同时有一定的亲水性，丙酮、甲醇为亲水性，对于含油脂较多的熟肉制品样品，正己烷和二氯甲烷提取效率相对较高，但是正己烷的亲油性太强，对水溶性的N-亚硝基二甲基胺溶解性较差，有峰形展宽的现象，综合考虑选择二氯甲烷作为提取溶剂，经过超声法提取样品中的N-亚硝胺。

2.3.2 萃取溶剂体积的优化

在其他实验条件相同的情况下，对20.00 g空白样品加入固定质量浓度的混合N-亚硝胺标准溶液进行加标实验，比较二氯甲烷用量20、30、40、50、60 mL 5个水平的萃取效果。由图2可知，二氯甲烷体积20～40 mL时，二氯甲烷用量与色谱图对应的峰响应强度成正比；用量40～60 mL时平均峰响应强度基本不变。因此选用40 mL为萃取体积。

2.3.3 固相萃取净化柱的优化

乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）为一种弱阴离子交换吸附剂，主要去除脂肪酸、油脂和极性色素，ODS-C18（C18）具有疏水作用，可去除油脂和非极性极强的干扰物，目前这两种填料被广泛应用于食品中农药残留检测。王秀元等[24]采用活性炭柱净化腌制水产品，对亚硝胺的回收率达87%，杨宁等[25]采用氧化铝和C18混合小柱净化腌菜中9种亚硝胺，回收率在75.7%～116.1%。

本实验对5种固相萃取柱（PSA柱、PSA-C18混合柱、C18柱、活性炭柱、酸性氧化铝柱）的净化效果进行了比较。通过样品加标实验，比较每种萃取柱分别对9 种N-亚硝胺的回收率以确定最佳的固相萃取柱。由表2可知，PSA和C18混合柱的净化效果最好，回收率可达83.43%～94.92%。这是因为肉制品中含有大量的油脂和脂肪酸，PSA和C18可以很好地去除油脂和脂肪酸，因此本实验采用PSA和C18混合柱对样品进行净化。

2.4 标准曲线和灵敏度

分别配制9 种N-亚硝胺系列质量浓度的混合标准溶液进行GC-MS测定，每个水平重复测定3 次，采用外标法进行定量，以定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，以其质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得到的9 种N-亚硝胺的线性方程见表3。该方法重现性好，灵敏度高，相关系数达0.999 2以上。

2.5 回收率及精密度

3 结 论

本研究所建立的气相色谱-质谱联用法快速测定肉制品中9 种挥发性N-亚硝胺含量的分析方法，通过比较不同提取方法和不同固相萃取小柱净化效果的影响，优化了实验分析条件。较GB/T 5009.26—2003前处理简单快速，特异性强，重现性好，大幅缩短检测时间，适用于高通量分析检测N-亚硝胺类化合物，是一种易于操作，灵敏度高的测定方法。

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