HPLC法测定天仙子东莨菪碱和莨菪碱的含量

HPLC法测定天仙子东莨菪碱和莨菪碱的含量

李岩1， 孟庆勇1， 赵欣1， 孙婷1， 李晓静1,2， 程雪梅2， 王长虹2

(1新疆医科大学药学院药剂物化教研室， 乌鲁木齐830011；2上海中医药大学中药研究所；中药标准化教育部重点实验室；

中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室; 上海市复方中药重点实验室， 上海201210)

摘要：目的建立天仙子药材中东莨菪碱和莨菪碱的高效液相测定方法。方法采用Symmetrix ODS-H色谱柱，以乙腈-0.1%三氟乙酸水(14∶86)为流动相，检测波长210 nm，流速1.0 mL/min，测定天仙子药材中东莨菪碱和莨菪碱的含量。结果氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的线性范围分别为4.02～513.64 μg/mL (r=0.999 9)和4.00～512.00 μg/mL (r=0.999 8)，平均回收率分别为98.41%和98.79%。结论HPLC法测定准确、可控，能快速、简便地控制天仙子药材的质量。

关键词：天仙子； 莨菪碱； 东莨菪碱； 高效液相色谱法

中图分类号：R917文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.016

[收稿日期：2014-9-12]

基金项目：国家自然科学基金(81160137)；新疆维吾尔自治区教育厅青年教师科研培育基金(XJEDU2011S23)

作者简介：李莉(1987-)，女，在读硕士，研究方向：微量元素与健康。

Determination of total alkaloids from Hyoscyami semen by HPLC

LI Yan1, MENG Qingyong1, ZHAO Xin1, SUN Ting1, LI Xiaojing1,2, CHENG Xuemei2, WANG Changhong2

(1DepartmentofPharmaceutics,CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830011China；2InstituteofChineseMateriaMedica,ShanghaiUniversityofTraditional

ChineseMedicine;TheMOEKeyLaboratoryforStandardizationofChineseMedicinesand

TheSATCMKeyLaboratoryforNewResourcesandQualityEvaluationofChineseMedicines;

ShanghaiKeyLaboratoryofTCMComplexPrescription,Shanghai201210,China)

Abstract:ObjectiveTo establish quality control methods for determining active ingredients of the total alkaloids from Hyoscyami semen. MethodsThe determination of scopolamine and hyoscyamine in H. semen was performed on Symmetrix ODS-H column and mobile phase consisted of acetonitrile -0.1% trifluoroacetic acid (14∶86). The flow rate was 1.0 mL/min and the UV detective wavelength was set at 210 nm. ResultsThe linear ranges of scopolamine and hyoscyamine were 4.02-513.64 μg/mL (r=0.999 9) and 4.00-512.00 μg/mL (r=0.999 8), and the average recoveries were 98.41% and 98.79% respectively. ConclusionThe method could be easily used to evaluate the quality of H. semen, quick, accurate and controllable.

Key words：Hyoscyamisemen; hyoscyamine; scopolamine; HPLC

天仙子为茄科(Solanaceae)植物莨菪(Hyoscyamus niger L.)的干燥成熟种子，最早收载于《神农本草经》。天仙子性温，味苦辛，有毒，具有定痫、止痛的功效，常用于治疗癫狂、风痹厥痛、恶疮等症[1]。国内外学者已从天仙子的茎叶及种子中分离出近百种化合物，包括生物碱类、多糖类、黄酮类、香豆素类、木脂素酰胺类、甾族皂甙类等化合物[2-7]。其中托烷类生物碱(主要为莨菪碱和东莨菪碱)被认为是天仙子发挥治疗神经系统作用相关疾病的有效成分。目前的研究中有关天仙子的定量测定以HPLC法为主，2010年版《中华人民共和国药典》中，HPLC法测定天仙子药材中阿托品和东莨菪碱含量的色谱条件中流动相组成极其复杂。本研究采用以乙腈-0.1%三氟乙酸(14∶86)为流动相，对东莨菪碱和阿托品的分离效果良好，以此建立了更为简易的HPLC含量测定方法，为药材的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

Waters 2695-2998型高效液相色谱仪(Waters Co.)，DKZ-2系列电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备有限公司)，MDF1-100手提式中药粉碎机(上海民德机械制造有限公司)，N-1001 旋转蒸发仪，SHB-III循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)，DK-S24型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)，5415R离心机 (Eppendorf，德国)， BS/BT电子天平( 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，分析色谱柱Symmetrix ODS-H(4.6 mm×250 mm，5μm)，超纯水器( Millipore公司)。

天仙子(批号：20120510-1、20120510-2、20120510-3，安徽德昌药业饮片有限公司提供，产地：新疆)，由吴立宏副研究员(上海中药标准化研究中心)鉴定为茄科植物天仙子的(Hyoscyamus niger L.)的干燥种子；氢溴酸东莨菪碱对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100050-200309)，硫酸阿托品(Sigma-Aldrich，批号：077K1047)，乙腈 (色谱纯，Fisher)，甲醇 (色谱纯，Fisher)，乙醇为工业级，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备分别精密称取氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品对照25.08、25.00 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即得含氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品对照品浓度分别为1.003和1.000 mg/mL的混合对照品储备液。

2.2供试品溶液的制备参照2010版《中华人民共和国药典》[8]测定天仙子药材的含量测定方法，制备天仙子的供试品溶液。

2.3色谱条件与系统适应性试验色谱柱Symmetrix ODS-H (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相:乙腈-0.1%三氟乙酸 (14∶86)；检测波长λ为210 nm；流速:1.0 mL/min；柱温: 30℃；进样量:20 μL。在此条件下，氢溴酸东莨菪碱、硫酸阿托品与样品中其他成分达到基线分离(图1)。

2.4线性关系的考察精密量取“2.1”项下混合标准品储备液0.04、0.06、0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56、5.12 mL,分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液20 μL注入色谱仪进行测定并记录色谱图，以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归。氢溴酸东莨菪碱的线性回归方程为: Y=20 570X+20 934，r=0.999 9(n=8)；硫酸阿托品的线性回归方程为: Y=23 612X+59 928，r=0.999 7(n=8)。氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品分别在4.02～513.64 μg/mL和4.00～512.00 μg/mL范围内与色谱峰面积有良好的线性关系。

1：氢溴酸东莨菪碱；2：硫酸阿托品

2.5最低检测限将混合对照品储备液按逐步稀释法稀释，信噪比约为3∶1时，氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的最低检测限分别为2.5 μg/mL和2.0 μg/mL。

2.6稳定性试验取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、48 h测定，计算氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的含量及RSD%，结果氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的RSD%分别为1.41% 和1.61%。

2.7精密度试验精密吸取混合对照品储备液0.5、1.0、2.0 mL分别置于10 mL量瓶中，纯化水定容。于1 d内测定5次,计算日内精密度RSD(%)；连续测定3 d，进行日间精密度测试，结果氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的日内、日间精密度RSD均<2.0%，说明日内、日间精密度良好。

2.8重复性试验取同一批样品，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，计算东莨菪碱、莨菪碱的含量(注：东莨菪碱含量=氢溴酸东莨菪碱含量×0.789;莨菪碱含量=硫酸阿托品的含量×0.855)及RSD(%)，结果东莨菪碱、莨菪碱的RSD分别为1.40%、1.51%，表明方法重复性良好。

2.9加样回收率试验取已测定准确含量的天仙子药材粉末约1.0 g，共9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法处理，测定，计算加样回收率，结果见表1。氢溴酸东莨菪碱和硫酸阿托品的高、中、低3个浓度的加样回收率均在98%～120%范围内，RSD<2.0%。

表1　回收率测定结果( ±s)

表1　回收率测定结果( ±s)

加入量/μg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%氢溴酸东莨菪碱102.72232.2697.73±2.00128.41252.6898.74±2.2398.41±1.891.92154.09284.0998.76±1.96硫酸阿托品171.52386.2999.64±2.29215.04427.3798.57±2.2398.79±1.971.99256.00466.7398.15±1.89

2.10样品含量测定将3批天仙子药材按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样20 μL测定，记录各个峰面积，分别计算天仙子中莨菪碱和东莨菪碱的含量，结果见表2。3批天仙子药材中东莨菪碱的含量在0.01%左右，莨菪碱的含量在0.02%左右。

表2　样品含量测定结果( ±s)

表2　样品含量测定结果( ±s)

成分批号样品含量/%RSD/%20120510-10.0104±0.00021.92氢溴酸东莨菪碱20120510-20.0101±0.00021.9820120510-30.0103±0.00032.9120120510-10.0184±0.00021.09硫酸阿托品20120510-20.0171±0.00021.1720120510-30.0199±0.00021.00

3讨论

目前有关托烷类生物碱的含量测定方法主要有紫外分光光度法[9]、薄层色谱法[10]、毛细管电泳法[11]、离子对色谱发法[12]、HPLC法[13]等。对天仙子药材中托烷类生物碱的含量测定方法多以《中华人民共和国药典》中HPLC测定方法为主，2010年版《中华人民共和国药典》中HPLC法测定天仙子药材中阿托品和东莨菪碱含量的色谱条件为：甲醇-乙腈-30 mmol/L醋酸钠缓冲液(含0.02%三乙胺、0.3% 四氢呋喃，用冰醋酸调pH值至6.0) (10∶5∶85)，其流动相组成极其复杂。本研究尝试了不同的流动相组成，发现阿托品和东莨菪碱对酸性流动相比较敏感，其中以乙腈-0.1%三氟乙酸(14∶86)为流动相，对东莨菪碱和阿托品的分离效果良好，以此建立了更为简易的HPLC含测方法。

托烷类生物碱也存在于洋金花和曼陀罗等植物中，并不是天仙子药材中的专属指标成分。因此，今后应该寻找天仙子中更专属的活性成分作为质控的指标，以提高和完善《中华人民共和国药典》的质量标准。

本实验对3批不同来源的天仙子药材中托烷类生物碱(莨菪碱和东莨菪碱合计)的含量进行测定，发现其含量较低，仅为0.03%左右，原因有待进一步研究。但目前结果提示今后可从生产环节和资源建设着手，响应医药工业“十二五”规划对药材原料规范化、规模化、集约化的要求，逐步提高药材的品质。

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(本文编辑施洋)

通信作者：杨晓燕，女，教授，博士生导师，研究方向：微量元素与健康，E-mail：390068143@qq.com。

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