新疆维吾尔族、汉族结直肠癌患者中KRAS及BRAF基因突变差异及其与预后的关系研究

新疆维吾尔族、汉族结直肠癌患者中KRAS及BRAF基因突变差异及其与预后的关系研究

孙毅1, 艾力江·吐尔逊1, 杨娜2，古丽比也·沙比尔1, 赵化荣1, 王文然1, 刘攀1,

肖蕾1, 玛依努尔·艾力1, 包永星1

(1新疆医科大学第一附属医院肿瘤中心， 乌鲁木齐830054;2新疆维吾尔自治区人民医院放疗一科， 乌鲁木齐830001)

摘要:目的探讨新疆维吾尔族(维族)、汉族结直肠癌伴肝转移患者中KRAS基因及BRAF基因突变差异及其与临床病理特征和预后的关系。方法选择新疆医科大学第一附属医院2005年1月-2010年12月收治的100例新疆维、汉族结直肠癌伴肝转移患者,应用PCR及Pyrosequencing测序法检测分析KRAS基因及BRAF基因突变情况，分析其与临床病理特征和预后的关系。结果维、汉族结直肠癌伴肝转移患者的KRAS与BRAF基因突变率分别为28%(28/100)与5%(5/100)。50例汉族患者中KRAS基因突变18例, BRAF 基因突变2例；50例维吾尔族患者中KRAS基因突变10例，BRAF基因突变3例。原发肿瘤组织学分级、区域淋巴结转移、脉管瘤栓、肝外侵犯或转移、KRAS和BRAF为结直肠癌的预后影响因素(P<0.05)；多因素分析显示，脉管瘤栓(P=0.035)、KRAS基因(P=0.001)为结直肠癌的独立的预后因素。结论在新疆维、汉族结直肠癌伴肝转移患者中，脉管瘤栓及KRAS基因具有主要的预后价值。积极检测KRAS基因，可望延长患者生存期。

关键词:KRAS； BRAF; 新疆； 维吾尔族； 汉族； 结直肠癌； 同时性肝转移； 预后

中图分类号：R657.1文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.011

[收稿日期:2014-01-14]

Prognostic in role of KRAS and BRAF in colorectal cancer cases with

synchronous liver metastases in the Uyghur and Han nationality in Xinjiang

SUN Yi1，Ailijiang Tuerxun1，YANG Na2，Gulibiye Shabier1，ZHAO Huarong1，WANG Wenran1，

LIU Pan1，XIAO Lei1，Mayinuer Aili1，BAO Yongxing1

(1DepartmentofOncologyCenter,TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,

Urumqi830054,China;2TheXinjiangUygurAutonomousRegionPeople′sHospitaloftheFirst

Departmentofradiotherapy,Urumqi830001,China)

Abstract：ObjectiveTo analyse the relations among clinical pathological characteristics, prognosis and gene mutation of KRAS and BRAF with whom carry Colorectal Cancer Cases and Synchronous Liver Metastases in the uyghur and han nationality in Xinjiang. MethodsThe clinical and pathological data of Colorectal Cancer Cases with Synchronous Liver Metastases in the Uyghur and han nationality in Xinjiang treated at Xinjiang MedicaI University from January 2005 to December 2010 were retrospectively reviewed and analyzed，including KRAS and BRAF. ResultsKRAS and BRAF tumor mutation rates were 28.0% and 5.0%, respectively. Of 50 cases Han nationality ,18 cases KRAS and 2 cases BRAF were gene multation, of the uyghur, 10 cases KRAF and 3 cases BRAF. Univariate analysis with Kaplan-Meier methods revealed that the differentiation of the primary tumor, N status， lymphatic and vascular invasion， extrahepatic disease, KRAS and BRAF were prognostic factors (P<0.05)． Multivariate analysis showed that lymphatic and vascular invasion (P=0.035)， KRAS (P=0.001) were independent prognostic factors of colorectal cancer patients with synchronous liver metastases． ConclusionThe lymphatic and vascular invasion and KRAS have significant prognostic value for colorectal cancer with synchronous Iiver metastases． It is necessary to detect KRAS gene for Colorectal Cancer Cases with Synchronous Liver Metastases in the uyghur and han nationality in Xinjiang.

Key words: KRAS gene and BRAF gene; Colorectal Cancer in the Uyghur and han nationality in Xinjiang; Synchronous liver;Prognosis

结直肠癌(colorectal cancer)是危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤的第3位[1]，我国结直肠癌发病率呈逐年上升趋势，远高于国际水平的2%。有研究显示50%～60%被诊断为结直肠癌的病人将发展为结直肠癌转移，其中80%～90%为不可切除的结直肠癌肝转移患者[2]。结直肠癌主要的治疗方法是手术和放化疗，但是疗效并不理想。随着现代肿瘤医学的快速发展、分子靶向药物的研发和个体化治疗的应用，使结直肠癌的治疗进入了分子靶向治疗的新时期。Ⅱ期和Ⅲ期临床随机试验结果显示, 使用抗表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体(西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗转移性结直肠癌，其疗效与KRAS基因有无突变密切相关[3-5]。KRAS基因野生型患者可从抗EGFR单抗单药治疗或联合化疗中获益，但KRAS基因第2号外显子的第12或13位密码子发生突变者不能受益。因此，美国《国家综合癌症网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》(2012)中明确提出，KRAS基因状态是使用EGFR单抗靶向药物的疗效预测指标，KRAS野生型患者可接受EGFR抑制剂的治疗，对于KRAS基因无突变(野生型)患者，建议检测BRAF基因，有BRAF V600E突变的患者可能对EGFR单抗靶向药物治疗无效。鉴于KRAS和BRAF基因对于指导结直肠癌患者临床用药的重要性，本研究采用PCR扩增-直接测序的方法检测分析新疆维、汉族转移性结直肠癌患者KRAS及BRAF基因的突变情况,并探讨其与临床病理特征和预后的关系。

1资料与方法

1.1临床资料选择新疆医科大学第一附属医院2005年1月-2010年12月收治的转移性结直肠癌患者100例，其中汉族50例，维吾尔族50例；男性37例，女性63例；年龄<60岁47例，≥60岁53例。纳入标准：(1)所有转移性结直肠癌患者都在术前被相关病理及检查所明确诊断并明确有转移,包括实验室检查、胸片、肠镜检查、病理活检及胸腹盆腔CT。(2)所有转移性结直肠癌患者在术前未行新辅助治疗。(3)所有转移性结直肠癌患者都经过影像学及病理检查评估分期。排除没有转移的结直肠癌患者。每例均取距肿瘤10 cm以上大肠黏膜作对照。

1.2检测方法选取经甲醛固定和石蜡包埋的肿瘤原发灶样本并切片，采用基因科技(上海)有限公司GTpure FFPE组织DNA提取试剂盒抽提并制备DNA模板。采用聚合酶链式反应扩增出KRAS第2外显子片段，用Pyrosequencing测序法(PyroMark ID型Pyrosequencing焦磷酸测序仪(瑞典Biotage AB公司产)检测该位点是否突变。

1.3KPS评分标准对患者的预后情况进行KPS评分。0～49分：生活不能自理,需特别照顾;50～79分：生活可自理,但不能维持正常活动或工作;80～100分：可正常工作,有轻微症状或体征。

1.4统计学处理所有资料采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析，卡方检验计算KRAS和BRAF基因在新疆维、汉转移性结直肠癌患者中相关临床病理参数的突变差异。Kaplan-Meier方法计算生存率，单因素分析采用Log-rank进行比较；生存率的多因素分析采用Cox风险模型逐步回归方法，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1随访结果与总生存情况所有病例均获随访。随访时间1～63个月，中位随访时间为24个月。失访3例，失访率为3%。 截止2012年12月30日，100例患者中有3例患者存活，1年、2年、3年、5年生存率分别为50.70%、28.80%、13.10%、1.50%，中位生存时间为12个月，生存曲线图见图1。

图1　维、汉族结直肠癌伴肝转移患者的生存曲线图

2.2KRAS基因突变情况及其类型100例样本中KRAS突变28例，突变率为28%；BRAF突变5例，突变率为5%。50例汉族患者中KRAS基因突变18例, BRAF基因2例；50例维吾尔族患者中KRAS基因突变10例，BRAF基因突变3例。KRAS基因第12位密码子的突变类型有GGT>GAT、GGT>G3T、GGT>AGT、GGT>TGT、GGT>GCT、GGT>CGT，第13位密码子的突变类型有GGC>GAC、GGC>TGC。BRAF基因最常见的突变类型为V600E。

2.3单因素分析结果单因素分析结果显示：原发肿瘤组织学分级、区域淋巴结转移、脉管瘤栓、肝外侵犯或转移、KRAS和BRAF均对预后有影响。原发肿瘤分化程度低者、有淋巴结转移者、有脉管瘤栓者、有肝外受侵者较无淋巴结转移者、无脉管瘤栓者及无肝外受侵者较者预后差，KRAS野生型较突变型预后相对差和BRAF野生型较突变型预后相对差；而患者性别、年龄、族别、KPS评分、原发肿瘤T分期、肝转移灶部位、肝转移灶最大直径、肝转移灶数目及肿瘤大体类型对预后无影响(P均>0.05),见表1。

表1　100例新疆维汉民族结直肠癌伴肝转移患者预后影响因素的单因素分析结果

2.4多因素分析结果将单因素分析中有意义的6个因素作自变量，生存时间作应变量，应用COX模型进行多因素分析后发现脉管瘤栓(图2)、KRAS (图3)为独立的预后危险因素(P<0.05)(表2)。

图2　脉管瘤栓与新疆维汉民族结直肠癌伴肝转移

患者的累计生存曲线图

图3　KRAS基因与新疆维汉民族结直肠癌伴肝转移

患者的累计生存曲线图

表2　维、汉族结直肠癌伴肝转移患者多因素分析结果

3讨论

本研究单因素及多因素分析结果显示，脉管瘤栓是新疆维、汉族结直肠癌伴肝转移患者预后的独立影响因素。这与国内外有关研究报道的结果相一致[6-7]。Nissan等[7]研究发现脉管瘤栓显著降低5年无病生存率(36%)和疾病特异性生存率(37%)。脉管指管径<300 μm的小动脉、小静脉和小的淋巴管，由于在光镜下不易区分，被笼统地称之为脉管。在肿瘤生长过程中，有大量的肿瘤微血管形成，为瘤细胞进入血液创造了良好的解剖学基础。一旦脉管内的瘤细胞自身形成同聚物或与白细胞、血小板形成异聚合物，即形成了脉管瘤栓[8]。脉管瘤栓进入黏膜下血管可以预测早期结直肠癌淋巴结转移，而侵入到血管外可以增加肝转移的风险，提示一般状况好的患者可以更好地耐受治疗，获得更多的治疗机会，从而延长生存期；而出现脉管瘤栓的患者，虽然尚未出现肿瘤的影像学改变，但已有远处播散的趋势，预后较差。特别是脉管瘤栓可以独立预测结直肠癌患者发生肝转移的风险,但是目前由于此类组织标本的缺乏，其相关机制还不是很清楚。

Roth等[9]报道约40%的结直肠癌患者中KRAS基因发生突变，主要集中在第二外显子的第12和13密码子上。KRAS基因作为结直肠癌中能够预测抗表皮生长因子受体的分子靶向治疗疗效的标记物已被广泛认可，但对其是否能够预测结直肠癌的预后仍存在争议[10]。肝转移是结直肠癌患者治疗的重点和难点，也是患者最重要的死亡原因之一[11]。对KRAS基因突变作为结直肠癌伴肝转移预后的标志物亦存在矛盾和争议。Petrowsky等[12]对小样本的回顾性研究中未发现KRAS基因对于患者生存的影响，而2个大的多中心协作性研究“RASCAL Ⅰ&Ⅱ”分析了2 721例和4 268例结直肠癌患者的临床资料，结果发现KRAS突变增加了肿瘤复发及死亡的风险，尤其是对Duke C期患者是影响无进展生存和总体生存的独立危险因素。需要强调的是，RASCAL研究没有报道单因素生存分析结果，多因素分析中未包括肝脏转移发生的情况以及是否接受手术治疗等对于预后的影响。此外，手术切除肝脏转移灶是治愈结直肠癌肝转移的最佳治疗方式[13-14]。梁立等[15]根据将转移灶是否接受手术切除进一步分组分析，结果提示，在无肝转移组中KRAS基因突变者肿瘤总生存期较短，在肝转移灶切除者中KRAS突变者无复发生存时间较短，且是影响肝转移组中转移灶切除术后总体生存的独立危险因素。与Cejas等[16]研究结果相似。但是在同时性转移亚组、异时性转移亚组中预后的差异未见统计学意义，可能与样本例数较少及随访时间较短有关。本研究单因素及多因素分析结果显示KRAS基因是新疆维、汉族结直肠癌伴肝转移患者独立的预后因素，这与Conlin等[17]的研究结果相似，提示KRAS基因突变是独立于结直肠癌分期的不良预后因素。

综上所述，本研究发现脉管癌栓、KRAS是影响新疆维汉结直肠癌伴肝转移的重要因素。但新疆维、汉结直肠癌伴肝转移预后影响因素及其相对危险度的最终结论，尚需通过大样本的前瞻性研究进一步验证。

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(本文编辑杨晨晨)