结肠癌组织中NDRG1及TGF-β 1的表达及意义

结肠癌组织中NDRG1及TGF-β1的表达及意义

曹翌1，彭春辉1，杨开1，张小薄2

(1锦州石化医院，辽宁锦州121000；2中国医科大学附属盛京医院)

摘要：目的观察结肠癌组织中NDRG1及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达变化，探讨其临床意义。方法选取手术切除的结肠癌组织及其癌旁正常组织标本各78例，采用免疫组化法检测其NDRG1、TGF-β1蛋白表达；切取新鲜结肠癌组织及癌旁正常组织16例，采用qRT-PCR法及Western blotting法检测其NDRG1、TGF-β1的mRNA及蛋白表达水平。结果结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1阳性表达率高于癌旁组织(P均<0.05)。NDRG1及TGF-β1蛋白阳性表达与肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度和Dukes分期有关(P均<0.05)。结肠癌组织中NDRG1与TGF-β1蛋白阳性表达率呈正相关(r=0.231，P<0.05)。结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1蛋白及mRNA相对表达量高于癌旁组织(P均<0.05)。结论 NDRG1及TGF-β1在结肠癌组织中高表达，提示结肠癌预后不良，二者可能对结肠癌的恶性行为具有调控作用。

关键词：结肠肿瘤；NDRG1基因；转化生长因子β1

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.034

中图分类号：R735.3

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2015)41-0081-04

收稿日期：(2015-07-06) (2015-04-10)

结肠癌发病为多基因、多因素共同作用的结果[1]。NDRG1属NDRG家族成员,目前其作用存在抑癌及促癌两种不同观点，有研究认为其在不同组织来源、不同分化程度及肿瘤的不同阶段对肿瘤恶性行为作用不同[2]。有研究认为，NDRG家族可能通过转化生长因子β1(TGF-β1)对恶性肿瘤细胞的分化、增殖及凋亡等恶性行为发挥作用[3]。本研究对结肠癌组织中NDRG1及TGF-β1蛋白表达进行检测，并分析其与结肠癌临床病理特征的相关性，探讨NDRG1及TGF-β1在结肠癌恶性行为中的作用及对预后的预测价值。

通信作者：曹翌

1材料与方法

1.1材料选取2013年1月~2014年7月于锦州石化医院及中国医科大学附属盛京医院普通外科手术切除并经病理检查证实的结肠癌及其癌旁正常组织标本各78例，石蜡包埋；在手术标本移除后切取少量新鲜直径0.5 cm结肠癌及癌旁正常组织16例，置于液氮中冷冻保存。鼠NDRG1多克隆抗体及兔TGF-β1多克隆抗体购自美国SantaCruz公司，SP免疫组化试剂盒、miRNA提取分离试剂盒、TRIzol及Lipofectamine 2000购自日本Takara公司。引物由大连宝生物技术有限公司设计合成，NDRG1上游引物：5′-CCTCUCATACGCGCGGAC-3′，下游引物：5′-CGCGGACCTAGUUGATCG-3′；TGF-β1上游引物：5′-CCAGGCUCGTTCTAGATGCUC-3′，下游引物：5′-CCGCUTCCTAGGAGACACCG-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGCCUAGCTCACAUCCGCG-3′，下游引物：5′-CUCGTCTCGAGTAGUCTGC-3′。

[4] Goldhaber SZ, Bounameaux H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis[J]. Lancet, 2012,379(9828):1835-1846.

[5] Agnelli G, Becattini C. Acute pulmonary embolism[J]. N Engl J Med, 2010,363(3):266-274.

[6] Jaff MR, McMurtry MS, Archer SL, et al. Management of massive and submassive pulmonary embolism, iliofemoral deep vein thrombosis, and chronic thromboembolic pulmonary hypertension: a scientific statement from the American Heart Association[J]. Circulation, 2011,123(16):1788-1830.

[7] Guyatt GH, Akl EA, Crowther M, et al. Executive summary: antithrombotic therapy and prevention of thrombosis, 9th ed: American college of chest physicians evidence-based clinical practice guidelines[J].Chest, 2012,141(2 Suppl):7-47.

[8] 郭朝军．术后肺梗塞的预防[J]．中外医学研究，2011，9(17)：123．

[9] Tapson VF. Acute pulmonary embolism[J]. N Engl J Med, 2008,358(10):1037-1052.

[10] 吴轶雄，林国盛，陈国欢，等．溶栓加序贯抗凝治疗次大面积肺栓塞疗效观察[J]．临床内科杂志，2011，28(12)：835-836．

[11] 程显声，何建国，柳志红，等.对急性肺栓塞中危患者溶栓疗法的建议[J]．中华医学杂志，2011,91(32):2236-2238.

[12] Becattini C, Lignani A, Masotti L, et al. D-dimer for risk stratification in patients with acute pulmonary embolism[J]. Thromb Thrombolysis, 2012,33(1):48-57.

[13] Kabrhel C, Mark Courtney D, Camargo CA Jr, et al. Factors associated with positive D-dimer results in patients evaluated for pulmonary embolism[J]. Acad Emerg Med, 2010,17(6):589-597.

[14] 刘晓宇，刘运秋．急性肺动脉栓塞患者血浆中D-二聚体水平与死亡率的相关性分析[J]．山东大学学报(医学版)，2010，48(6)：96-99.

[15] 邓朝胜，高少勇，林其昌，等.抗凝治疗对老年与非老年肺栓塞患者D-二聚体的影响[J]．中华老年医学杂志，2012，31(6)：475-478.

[16] 白重阳，吕晓丽，苏征，等．急性肺栓塞血浆NT-ProBNP与D-二聚体水平的动态分析[J]．国际检验医学杂志，2014,35(5)：599-600.

[17] 曾秀芳,李志海,郭芳青.彩色多普勒超声在下肢深静脉血栓诊断中的应用[J].国际医药卫生导报,2010,16(20):2496-2498.

1.2结肠癌组织及癌旁组织中NDRG1、TGF-β1表达检测

1.2.1NDRG1、TGF-β1蛋白定性检测采用免疫组化法。以已知小肠组织中NDRG1和TGF-β1蛋白阳性表达作为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。石蜡块切片(4 μm厚)，60 ℃烤箱中烘烤2 h后进行脱水、脱蜡、抗原修复，3% H2O250 mL洗涤后37 ℃烤箱内烘干25 min，磷酸盐缓冲液洗涤3次。加1∶500稀释一抗置入湿盒中4 ℃下孵育过夜。室温复温20 min，PBS再洗涤3次，加入二抗37 ℃孵育30 min，二氨基联苯胺显色、苏木素复染10 min、流水洗净后盐酸乙醇分化20 s，再次冲洗30 min，脱水透明，二甲苯中性树胶封片。由2位高年资病理医师采用双盲法评估结果。400倍显微镜下每张切片随机选取5个视野，每视野计数100个细胞，计算阳性细胞百分比。阳性细胞百分比<10%计0分，10%～24%计1分，25%～49%计2分，50%～74%计3分，≥75%计4分；染色强度评分：无着色计0分，浅黄色计1分，黄或深黄色计2分，褐或棕褐色计3分；二者相加>2分即为表达阳性。

1.2.2NDRG1、TGF-β1蛋白半定量检测采用Western blotting法。取新鲜组织标本约100 mg，加500 μL蛋白裂解液后剪碎，冰上静置30 min,4 ℃、12 000 g离心30 min，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，样品均定量为6 g/L，每条泳道上样蛋白量为50 μg，采用12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶在电压70 V条件下进行80 min电泳，电转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h后加入一抗，4 ℃温度下孵育过夜，TBST洗膜、加入二抗、室温下孵育2 h，TBST清洗，ECL发光同时进行凝胶显像仪显像后采用Quantity One软件分析灰度值。

1.2.3NDRG1、TGF-β1mRNA检测采用qRT-PCR法。剪取新鲜结肠癌及癌旁组织标本约100 mg，进行液氮物理研磨，按TRIzol步骤进行细胞株总RNA的分离、纯化，依据逆转录/扩增试剂盒说明书进行逆转录及扩增实验，反应体系：SYBR Green 12.5 μL、DEPC-treated water 8.5 μL、cDNA模板2.0 μL、10 μmol/L的上下游引物各1.0 μL，总体积25 μL；反应条件：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性5 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，40个循环。所有反应均设复孔，GAPDH作为内参照，△△Ct法进行结果分析。

1.3统计学方法采用SPSS18.0统计学软件。计量资料用±s表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析；计数资料的比较采用χ2检验。NDRG1与TGF-β1的相关性采用Spearman-rank相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1结肠癌组织及癌旁组织中NDRG1、TGF-β1蛋白阳性表达情况NDRG1、TGF-β1蛋白阳性染色位于细胞质。结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1蛋白阳性表达率分别为67.95%(53/78)、73.08%(57/78)，癌旁组织中分别为21.79%(17/78)、34.62%(27/78)，结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1蛋白阳性表达率高于癌旁组织(P均<0.05)。

2.2结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1蛋白阳性表达与临床病理参数的关系结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1的蛋白阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、病理分型、病理类型无关，而与肿瘤直径、浸润深度、淋巴结转移、分化程度和Dukes分期有关(P均<0.05),见表1。

2.3结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1蛋白阳性表达的相关性Spearman rank相关分析结果显示，结肠癌组织中NDRG1与TGF-β1的蛋白阳性表达率呈正相关(r=0.231，P<0.05)。

2.4结肠癌组织及癌旁组织中NDRG1、TGF-β1蛋白相对表达量结肠癌组织中NDRG1蛋白、TGF-β1蛋白相对表达量0.864±0.219、0.769±0.425，癌旁组织中分别为0.323±0.104、0.317±0.154，结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1蛋白表达量高于癌旁组织(P均<0.05)。

2.5结肠癌组织及癌旁组织中NDRG1、TGF-β1mRNA的相对表达量结肠癌组织中NDRG1与TGF-β1mRNA的相对表达量分别为1.367±0.281、1.379±0.326，癌旁组织分别为0.663±0.183、0.538±0.217，结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1mRNA的表达水平高于癌旁组织(P均<0.05)。

表1　结肠癌组织中NDRG1、TGF-β 1蛋白阳性表达与临床病理参数的关系(例)

3讨论

结直肠癌发病率以每年3%～10%速度增长，死亡率居我国恶性肿瘤第5位，浸润及转移是结肠癌死亡的主要原因[4]。手术切除是结肠癌治疗的主要手段，早期发现和早期诊断是提高结肠癌根治性手术切除率及生存期的基础，对结肠癌相关基因的筛查及治疗靶点的选择是目前研究的方向。

NDRG1在不同恶性肿瘤细胞及不同种族人群表达水平有区别[5]，在肿瘤发展的不同阶段表达水平也不同。有研究结果显示，在肺癌A549细胞NDRG1过表达会逆转TGF-β1对A549细胞Snail表达的诱导作用。TGF-β1通过Smad信号通路调控Snail表达，促进p-Smad、p-AKT磷酸化。但是，过表达NDRG1明显抑制AKT磷酸化，但对Smad磷酸化却无影响，可见NDRG1只参与TGF-β1对AKT的调控，从而抑制Snail表达。NDRG1对AKT的抑制可能与NDRGl调控PTEN表达相关[6]。研究结果显示，NDRG1与胰腺癌的恶性行为呈正相关，其表达上调提示胰腺癌的不良预后[7]。在肝细胞癌中，NDRG1可能通过AKT信号通路调控TGF-β1表达，从而促进恶性肿瘤上皮间质转化(EMT)形成[8]。在Ⅰ、Ⅱ期宫颈腺癌组织中NDRG1高表达促进肿瘤血管发生、发展，从而缩短患者的生存时间，并提示愈后不良[9]。NDRG1 mRNA和蛋白在中等分化胰腺癌细胞Capan-1中因缺氧上调，在分化差的Panc-1细胞系中无变化，NDRG1对胰腺癌细胞分化程度具有标志物作用。但也有研究结果与其相反，可能在不同分化阶段及缺氧程度不同的条件下，NDRG1表现为抑癌及促癌双重作用[10]。TGF-β1可激活细胞内多条信号通路对细胞生物学行为进行调节[11]。TGF-β1信号通路活化与肿瘤发生及发展密切相关,在不同条件下也表现出促癌或抑癌双重作用。在正常上皮细胞中，TGF-β1通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子而抑制细胞增殖；而在结肠癌细胞，TGF-β1会诱导肿瘤细胞EMT、转移及浸润，自抑癌向促癌活性转变[12]。TGF-β1在结肠癌HaCaT细胞中从转录水平即直接激活NDRG1表达，并通过Smad2、Smad3及Smad4的转录调节活性激活NDRG1转录，Sp1过表达会进一步提高TGF-β1诱导NDRG1启动子活性[13]。NDRG1高表达与胰腺癌微血管密度升高具有相关性，进一步提示其促癌活性。多种原因可诱导TGF-β1功能改变,多种因素诱发TGF-β1增殖抑制通路突变失活是主要原因,在结肠癌细胞TGF-β1缺陷修复通路不能有效激活以抑制基因缺陷信号通路,使其自抑癌基因向促癌基因转变[14]。

本研究结果显示，NDRG1及TGF-β1在结肠癌组织中表达高于癌旁组织。NDRG1及TGF-β1蛋白的阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、病理分型、病理类型无关，而与肿瘤直径、淋巴结转移、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度和Dukes分期有关；NDRG1及TGF-β1表达水平升高提示结肠癌的恶性行为。有研究认为，分化的细胞处于缺氧环境中可表达NDRG1，NDRG1能抑制肿瘤的侵袭及转移，但随着缺氧加重，NDRG1可能对肿瘤的生长转变为促进作用。本研究的病理组织均为进展期结肠癌，而以往的研究多为结肠癌离体细胞水平，肿瘤细胞所处的环境及细胞的生长阶段不同，NDRG1表达的生物学特征也有差异[15]。本研究结果提示，结肠癌组织中NDRG1与TGF-β1蛋白的阳性表达率呈正相关性，二者可能在结肠癌病理学特征中具有协同作用；分子生物学研究结果也显示，NDRG1在结肠癌演变过程中在表观遗传学方面的改变会对TGF-β1的功能具有调节作用，NDRG1会通过与靶基因3′端非翻译区不完全配对，以抑制靶基因mRNA翻译或降解,从而参与细胞分化、增殖、发育及代谢的生物过程。NDRG1可能参与TGF-β1对细胞周期的调控。本研究结果显示，结肠癌组织中NDRG1、TGF-β1在蛋白水平及mRNA水平的表达高于癌旁正常组织，这与免疫组化结果一致，提示在mRNA水平即以发生NDRG1及TGF-β1的调控。

综上所述，NDRG1及TGF-β1在结肠癌组织中高表达，二者的阳性表达与临床病理指标具有相关性，提示直肠癌的恶性行为及不良预后，可作为结肠癌预后的标志物，是进一步基因治疗的靶点之一。

参考文献：

[1] Chow CJ, Al-Refaie WB, Abraham A, et al. Does patient rurality predict quality colon cancer care: a population-based study[J]. Dis Colon Rectum, 2015,58(4):415-422.

[2] Song Y, Lv L, Du J, et al. Correlation of N-myc downstream-regulated gene 1 subcellular localization and lymph node metastases of colorectal neoplasms[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,439(2):241-246.

[3] Kim JT, Kim JW, Kang YH, et al. NDRG2 and PRA1 interact and synergistically inhibit T-cell factor/β-catenin signaling[J]. FEBS Lett, 2012,586(22):3962-3968.

[4] Langman G, Patel A, Bowley DM. Size and distribution of lymph nodes in rectal cancer resection specimens[J]. Dis Colon Rectum, 2015,58(4):406-414.

[5] Koshiji M, Kumamoto K, Morimura K, et al. Correlation of N-myc downstream-regulated gene 1 expression with clinical outcomes of colorectal cancer patients of different race/ethnicity[J]. World J Gastroenterol, 2007,13(20):2803-2810.

[6] 刘浩,宋莹,贺智敏.过表达NDRG1对TGF-β诱导肺癌A549细胞上皮-间质转化的逆转作用[J].中国医师杂志,2015,17(5):710-713.

[7] 张小薄,谭晓冬,王怀涛.NDRG1与MMP-7在胰腺导管腺癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学,2015,23(13):1859-1862.

[8] Lu WJ, Chua MS, So SK, et al. Suppressing N-Myc downstream regulated gene 1 reactivates senescence signaling and inhibits tumor growth in hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesi, 2014,35(4):915-922.

[9] 杨成万，陶明珠，周铁军，等.在宫颈腺癌组织中的表达及临床意义[J].山东医药,2014,54(5):15-17.

[10] 刘庆宏,姜琳,孙灿林，等.上调NDRG1基因表达对人胰腺癌细胞MMP-9、VEGF表达及侵袭和迁移的影响[J].中华临床医师杂志,2013,25(14):6452-6456.

[11] Mao Z, Sun J, Feng B, et al. The metastasis suppressor, N-myc downregulated gene 1 (NDRG1), is a prognostic biomarker for human colorectal cancer[J]. PLoS One， 2013，8(7):e68206.

[12] Kim EJ, Kang JI, Kwak JW, et al. The anticancer effect of (1S,2S,3E,7E,11E)-3,7,11, 15-cembratetraen-17, 2-olide(LS-1) through the activation of TGF-β signaling in SNU-C5/5-FU, fluorouracil-resistant human colon cancer cells[J]. Mar Drugs, 2015,13(3):1340-1359.

[13] Tong D, Qu H, Meng X, et al. S-allylmercaptocysteine promotes MAPK inhibitor-induced apoptosis by activating the TGF-β signaling pathway in cancer cells[J]. Oncol Rep, 2014,32(3):1124-1132.

[14] Strzelczyk B, Szulc A, Rzepko R, et al. Identification of high-risk stage Ⅱ colorectal tumors by combined analysis of the NDRG1 gene expression and the depth of tumor invasion[J]. Ann Surg Oncol, 2009,16(5):1287-1294.

[15] 何欣蓉,蔡燕,付茂勇，等.磷酸化ERK、TGF-β受体Ⅱ和磷酸化Smad2蛋白在食管癌组织中的表达及意义[J].山东医药,2012,52(7):10-11.