脐带间充质干细胞移植对心力衰竭大鼠外周血CD + 4CD + 25Foxp + 3Treg细胞表达的影响

脐带间充质干细胞移植对心力衰竭大鼠外周血CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞表达的影响

赵子粼，叶常青，罗建春，马利贤，马武芝，梁晓辉，黄梁艳

(中国人民解放军第三〇三医院，南宁530021)

摘要：目的观察心力衰竭(HF)大鼠血浆N端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平及CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞比例变化，评价脐带间充质干细胞(WJ-MSCs)移植对HF大鼠免疫激活状态的影响。方法雄性Wistar大鼠48只，空白组(16只)不作处理正常饲养；其余大鼠皮下注射异丙肾上腺素制造HF模型成功后，随机分为干细胞移植组(16只)和模型组(16只)。干细胞移植组心肌内注射WJ-MSCs悬液，模型组予心肌内注射等量生理盐水。4周用流式细胞技术测定外周血CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞比例，酶联免疫吸附法测定三组大鼠血清中NT-proBNP及TNF-α、IL-10水平，并取大鼠心脏组织行免疫组化染色。结果HF大鼠血浆NT-proBNP、TNF-α均高于空白组，外周血CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞比例及IL-10水平低于空白组(P<0.05)；移植后4周，与模型组比较干细胞移植组NT-proBNP、TNF-α水平明显降低，外周血CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞比例及IL-10水平升高(P均<0.05)；CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞比例与血浆NT-proBNP水平呈负相关(r=-0.634,P<0.05)。结论 WJ-MSCs移植可显著提高HF大鼠外周血CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞比例，抑制炎症反应，改善HF症状。

关键词：心力衰竭；脐带间充质干细胞；CD`+4CD`+25Foxp`+3Treg细胞；大鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.41.005

中图分类号：R541.6

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)41-0013-03

基金项目：广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2013542)。

作者简介：第一赵子粼(1972-)，男，副主任医师，博士，主要从事心血管疾病的基础和临床研究工作。E-mail:no0@163.com

Abstract:Objective To observe the levels of N-terminal pro-brain natriuretic peptide (NT- proBNP) and the percentage change of CD`+4 CD`+25 Foxp`+3 Treg cells in rats with heart failure (HF) and to evaluate the effect of Wharton's jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSCs) transplantation on the immune activation of HF rats. MethodsForty-eight male Wistar rats were selected and 16 rats were fed normally without any treatment which was taken as the blank group, the rest of the rats were subcutaneously injected with isoprenaline to make the HF models, after the success of modeling, they were randomly divided into the stem cell transplantation group (n=16) and the model group (n=16). The rats in the stem cell transplantation group was administered with intramyocardial injection of WJ-MSCs suspension, while the rats in the model group was injected with the same amount of normal saline. Four weeks later, CD`+4 CD`+25 Foxp`+3 Treg cell proportion of the peripheral blood was detected by flow cytometry, the levels of NT-proBNP, TNF-α and IL-10 in the serum of the three groups were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the heart tissues of rats were collected for the immunohistochemical staining.Results The levels of NT-proBNP and TNF-α in the plasma of HF rats were significantly higher than those of the blank group, the CD`+4 CD`+25 Foxp`+3 Treg cell proportion in the peripheral blood and the level of IL-10 was significantly lower than that of the blank group (P<0.05). Four weeks after cell transplantation, compared with the model group, NT-proBNP and TNF-α were significantly decreased, while the CD`+4 CD`+25 Foxp`+3 Treg cell proportion in the peripheral blood and the IL-10 level were significantly increased in the stem cell transplantation group, and the difference was statistically significant (all P<0.05). There was negative correlation between the level of CD`+4 CD`+25 Foxp`+3 Treg cell and NT-proBNP expression (r=-0.634，P<0.05). Conclusion WJ-MSCs transplantation can significantly increase the CD`+4 CD`+25 Foxp`+3 Treg cell proportion in the peripheral blood of HF rats, inhibit inflammatory reaction and improve the symptoms of HF.

收稿日期：(2015-08-12)

Effect of WJ-MSCs transplantation on expression of CD+4CD+25

Foxp+3Treg cells in peripheral blood of rats with heart failure

ZHAOZi-lin,YEChang-qing,LUOJian-chun,MALi-xian,MAWu-zhi,LIANGXiao-hui,HUANGLiang-yan

(No. 303HospitalofPeople'sLiberationArmy,Nanning530021,China)

Key words: heart failure; umbilical cord mesenchymal stem cells; CD+4CD+25Foxp+3Treg cells; rats

心力衰竭(HF)是各种心血管疾病的终末阶段。诸多研究表明，在HF过程中大量炎症因子异常表达，存在免疫激活[1,2]，干细胞移植因为可抑制细胞凋亡、改善免疫功能，成为研究热点[3]。随着研究的不断深入，人们发现脐带间充质干细胞(WJ-MSCs)较成人间充质干细胞拥有更原始的免疫学特性，可作为干细胞的理想来源[4]。2013年6月～2015年1月，我们将WJ-MSCs应用于异丙基肾上腺素(ISO)诱导的HF大鼠，观察WJ-MSCs移植对HF大鼠外周血调节性T细胞表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物分组及处理采用雄性Wistar大鼠(购自广西壮族自治区疾病与预防控制中心)共48只，体质量190～220 g。其中空白组大鼠16只不作处理正常饲养，其余大鼠按照文献[5]报道的方法复制HF模型。制模成功后将HF大鼠随机均衡分入干细胞移植组(16只)和模型组(16只)，干细胞移植组予以心肌内注射1 mL细胞悬液(含1×106个WJ-MSCs)，模型组予心肌内注射等量生理盐水。WJ-MSCs由军事医学科学院制备及提供。

1.2心肌型态学观察于WJ-MSCs移植4周后麻醉所有HF大鼠，心腔内注射10%的氯化钾溶液1 mL，使心脏停止于舒张期，迅速取出心脏，去除心脏表面多余组织，冰盐水洗净。将待测心脏标本于40 g/L甲醛溶液中固定24 h，随后进行脱水、透明、浸蜡和包埋，垂直于心脏长轴连续切片，厚度3 μm，进行免疫组化染色，观察心肌形态学改变。

1.3NT-proBNP、TNF-α、IL-10水平检测在取出心脏标本前，通过心脏取出2 mL静脉血，于抗凝管中静置2 h，离心后分离血清取上清液，采用ELISA法检测NT-proBNP、TNF-α、IL-10，操作按照试剂盒使用说明书进行。

1.4外周血CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞检测取100 μL 外周血单个核细胞(PBMC)悬液(1×107个PBMC/mL)分别加入Falcon管中，加入小鼠抗大鼠CD4-FITC、CD25-PE单抗各10 μL，4 ℃避光孵育20 min，缓冲液洗涤。然后加入1 mL固定透膜液，4 ℃避光孵育1 h，1 500 r/min离心5 min，2 mL透膜液洗涤2次，1 500 r/min离心5 min；加入封闭抗体和Foxp3-PEcy5，室温避光孵育50 min；2 mL透膜液洗涤2次，1 500 r/min离心5 min；300 μL PBS 重悬细胞，立即上机检测。根据前向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，设置各通道之间的荧光补偿后，对CD+4CD+25细胞比例进行检测；以CD+4T淋巴细胞群设门，设置各通道之间的荧光补偿后，对CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例进行检测。

1.5 统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验；CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例与NT-proBNP水平的关系采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组大鼠心肌形态学改变制模成功后1周HF大鼠心脏组织切片显示存在大量心肌细胞坏死，多病灶变性病变，伴有炎性细胞浸润，明显的胶原纤维化。移植后4周，干细胞移植组与模型组心肌细胞坏死区域均缩小，干细胞移植组较模型组明显改善。

2.2各组大鼠外周血炎性因子、T细胞亚群水平变化HF大鼠血浆NT-proBNP、TNF-α水平均高于空白组大鼠，外周血CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例及IL-10水平低于空白组(P均<0.05)；移植后4周，与模型组比较，干细胞移植组NT-proBNP、TNF-α水平降低，外周血CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例及IL-10水平升高，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1　 各组大鼠外周血炎性因子、T细胞亚群

水平比较( ± s)

表1　 各组大鼠外周血炎性因子、T细胞亚群

组别nNT-proBNP(pg/mL)TNF-α(ng/L)IL-10(pg/mL)CD+4CD+25Foxp+3Treg(%)空白组 移植前1697.34±19.8624.21±4.5519.23±4.196.27±1.01 移植后4周1699.23±20.4724.33±4.6320.11±4.346.30±1.02模型组 移植前16763.71±147.14*69.54±12.74*23.26±5.04*4.46±0.83* 移植后4周12757.31±145.5162.53±11.9821.63±5.174.51±0.88干细胞移植组 移植前16761.56±146.35*68.48±12.60*24.31±5.26*4.39±0.78* 移植后4周15234.47±62.39#37.25±7.17#42.31±2.53#5.67±0.96#

注：与空白组同期比较，*P<0.05；与模型组移植后4周比较，#P<0.05。

2.3 CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞与NT-proBNP水平的关系Spearman相关分析显示， CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例与血浆NT-proBNP水平呈负相关(r=-0.634,P<0.05)，血浆NT-proBNP水平随CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例增高而降低。

3 讨论

调节性T细胞是一类细胞膜上高表达IL-2受体链的CD+4T细胞亚群(CD+4CD+25Treg细胞)，可通过分泌IL-10等抗炎性细胞因子发挥免疫抑制功能，在维持机体免疫应答稳态和免疫耐受方面具有非常重要的作用[6，7]。进一步研究表明，CD+4CD+25Treg细胞发挥抑制自身免疫的功能需要Foxp3基因的稳定持续和高水平表达，即CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞才是具有抑制自身免疫功能的Treg细胞。在众多炎症细胞因子中，TNF-α可诱发心肌细胞凋亡，降低心肌收缩力，促进心肌重构，已被证实在HF中起重要作用[8]。动物实验证实抑制TNF-α的表达有助于延缓心肌梗死后心室重塑[9,10]。通过调控炎症细胞治疗HF成为当前人们关注的课题之一。最新研究证实间充质细胞(MSCs)除具有细胞修复及改善心功能的作用外，还具有抑制炎症、免疫调节反应的作用[11]。MSCs不表达主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原及协同共刺激分子，制造免疫豁免环境，发挥炎症免疫调节作用。WJ-MSCs较其他MSCs拥有更强的分化增殖能力及更原始的免疫学特性，且不受伦理学限制，成为干细胞的理想来源[12]。

本研究发现，空白组大鼠心功能正常时，T细胞亚群发挥正常调控作用，TNF-α和IL-10水平处于平衡状态。造模成功的HF大鼠外周血T细胞亚群组成发生明显紊乱，外周血CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例明显下降。由于HF的加重，模型组大鼠TNF-α水平升高，同时IL-10水平代偿性升高，但IL-10增加不足以抵消TNF-α对心肌的损害，此时HF大鼠血浆NT-proBNP水平亦显著增加，提示造模后HF大鼠炎性细胞因子占据优势，抗炎细胞因子的增加不足以对抗炎性细胞因子介导的心肌损伤作用。本研究结果显示，在HF大鼠模型中，移植组给予WJ-MSCs治疗可有效调节T细胞亚群功能失衡，表现为升高CD+4CD+25Foxp+3细胞比例，代表Th1细胞反应为主的炎症因子TNF-α水平下降，表明促炎反应受到抑制；而代表Th2细胞反应为主的抗炎因子IL-10的水平则升高，表明抗炎反应受到了某种程度的加强。心肌形态学改变显示，WJ-MSCs移植组HF大鼠受损心肌组织局部炎性细胞浸润显著减少，Treg细胞数目的增加，可有效保护心肌，改善炎症反应，这可能是其治疗HF的作用机制之一。

血浆NT-proBNP水平与心功能密切相关，其水平随心功能降低而升高，NT-proBNP可作为诊断HF及判断预后的血浆标志物[13]。在本研究中，经过WJ-MSCs干预处理后，移植组大鼠血浆NT-proBNP水平较HF模型组下降，CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞数目增加；CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞数目与NT-proBNP水平呈负相关，此与相关研究报道一致[14]。

综上所述，WJ-MSCs移植治疗HF大鼠可显著增加CD+4CD+25Foxp+3Treg细胞比例，促进IL-10的分泌，抑制炎症因子TNF-α表达，调节全身炎症反应紊乱，促进免疫平衡，从而改善HF症状。

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