酸浆水中3种菌株的产酸能力及抗氧化活性

刘 力 李 理

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640)

豆腐黄浆水为豆腐制作过程中产生的黄色沥水，含有大量水苏糖、棉子糖等低聚糖，同时还含有蛋白质、大豆异黄酮及维生素P、K等营养物质，非常适合微生物的生长［1－3］。豆腐黄浆水在存贮的过程中自然发酵成为酸浆水，是一种良好的豆腐凝固剂，已在腐乳行业广泛应用［4］。自然发酵的酸浆中含有大量的乳酸菌、酵母及其他微生物，其中也可能含有有害微生物如蜡样芽孢杆菌［4］，因此，采用纯种发酵制备有利于提高酸浆的品质及安全性。

本课题组前期研究了鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵豆腐黄浆水并取得了良好的效果［5］，考虑到自然发酵形成的酸浆中可能包含有性能更优越的菌种，近期又研究了酸浆水中的微生物，并从中分离出2株解淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylolyticus L5、Lactobacillus amylolyticus L6)［6，7］和 1 株阿米塞毕赤氏酵母(Pichia amethionina Y)。本研究探讨了3个菌株单菌、或者组合发酵豆腐黄浆水的产酸能力，以及酸浆水的抗氧化能力。另外，考虑到豆腐黄浆水中富含异黄酮［1，2］，且乳酸菌发酵能增强食物体系的抗氧化能力［8］，本研究分别应用FRAP法、DPPH法以及螯合Fe2+相结合的方法［9］从不同的方面研究和评价酸浆水的抗氧化活性，为综合利用豆腐黄浆水提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

改良MRS液体培养基:牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉 5 g，葡萄糖 20 g，吐温-80 1 mL，K2HPO4·3H2O 2 g，NaAc·3H2O 5 g，柠檬酸氢二铵2 g，MgSO4·7H2O 0 .58 g，MnSO4·H2O 0.25 g;加蒸馏水定容到1 L，pH 6.4 ±0.2，121 ℃灭菌15 min。

豆腐黄浆水:从广东某腐乳厂采集;

菌种:Lactobacillus amylolyticus L5菌种保藏号为CGMCC NO.9371，Lactobacillus amylolyticus L6 保藏号为 CGMCC NO.9090，分离源为自然发酵的豆腐酸浆，经16SrDNA分子鉴定确定菌种名;Pichia amethionina Y，分离源为同一自然发酵的豆腐酸浆，经26SrDNA分子鉴定及生理生化试验确定菌种名;

TPTZ、DPPH、菲洛嗪和生育酚:美国Sigma公司;

其他试剂:均为国产分析纯;

pH计:PHS-3C型，上海精密科学仪器有限公司;

紫外分光光度计:UV230型，上海天美科学仪器有限公司;

电子天平:AL204-IC型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;

立式压力蒸汽灭菌器:LDZX-30KBS型，上海申安医疗器械厂;

超净工作台:SZX型，吴江净化设备总厂;

电热恒温培养箱:DHP-9052型，上海申贤恒温设备厂;

高速冷冻离心机:CR22G型，日本日立公司。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵剂的制备 在无菌环境下把活化好的解淀粉乳杆菌Lactobacillus amylolyticus L5、L6以及阿米塞毕赤氏酵母Pichia amethionina Y分别接入到121℃灭菌15 min的MRS液体培养基中和115℃灭菌15 min的麦芽汁液体培养基中，35℃培养24 h后即为母发酵剂。母发酵剂在豆腐黄浆水培养基(豆腐黄浆水经8 000×g离心10 min去除不溶物即得)中转接2～3次即可作为工作发酵剂。

1.2.2 阿米塞毕赤氏酵母、解淀粉乳杆菌及其复合模式发酵豆腐黄浆水样品的制备 豆腐黄浆水经8 000×g离心10 min去除不溶物后，分装于1.8 cm×20 cm试管中，使液体高度达到18 cm，用橡胶塞紧塞，作为培养基。121℃灭菌15 min，在无菌环境中按6%(V/V)的添加量分别接入解淀粉乳杆菌L5、L6和阿米塞毕赤氏酵母Y的工作发酵剂，编号分别标为L5，L6，Y。酵母菌和解淀粉乳杆菌复合发酵豆腐黄浆水的样品标号分别为L5+Y(3%L5+3%Y)、L6+Y(3%L6+3%Y)、L5+L6+Y(2%L5+2%L6+2%Y)。在 35℃下恒温培养 0，12，24，36，48，60 h 后。放置于 －20 ℃冰箱中待用。

1.2.3 pH值和酸度值的测定 使样品恢复室温，直接用测定样品的pH值;采用GB 5413.34—2010方法测定酸度值，用涅尔度(oT)表示。

1.2.4 酸浆水对Fe3+的还原能力(FRAP) 根据文献［10］略有改动。使用0.04 mol/L的HCl溶液配制TPTZ溶液(10 mmol/L)。将2.5 mL 的 TPTZ 溶液，2.5 mL 的 FeCl3溶液(20 mmol/L)和25 mL的乙酸盐缓冲液(300 mmol/L，pH 3.6)混合，制备得到FRAP溶液。取100 μL各类样品加入3 mL的FRAP溶液，在37℃下静置10 min，于8 000×g离心10 min，于593 nm处测定吸光度值。将生育酚(Trolox)作为标准物质。通过标准曲线 y=0.001 1x+0 .068 7，r2=0.999 3(y.吸光值;x.Trolox浓度，mmol)将酸浆水还原Fe3+的能力表示为mmol Trolox/mL样品。

1.2.5 酸浆水清除DPPH·自由基能力 根据文献［11］略有改变。分别取各类样品2 mL与2 mL DPPH(0.2 mmol/L，无水乙醇)溶液充分混合。在黑暗室温条件下反应30 min后，于8 000×g离心10 min，期间注意避光。在517 nm处测定吸光值。去离子水作为对照，生育酚(Trolox)作为标准物质。通过标准曲线 y= －0.012 6x+1.096 2，r2=0.999 6(y.吸光值;x.Trolox浓度，μmol)将酸浆水清除DPPH·自由基能力表示为μmol Trolox/mL样品。

1.2.6 酸浆水对Fe2+的螯合作用 根据文献［12］略有改动。样品经过8 000×g离心10 min，量取3 mL各类样品，与50 μL现配FeCl2(2 mmol/L)水溶液充分混匀，室温下静置1 min。加入100 μL的菲咯嗪溶液(5 mmol/L)混合均匀。去离子水作为对照，在室温下反应20 min，562 nm测定吸光值。样品的Fe2+螯合能力表示为螯合率，按式(1)计算:

式中:

C——螯合 Fe2+能力，%;

Ac、Asi——分别为对照样和各类样品的吸光值;

Ai——不添加菲咯嗪时各类样品的吸光度值。

1.2.7 数据处理与分析 采用SPSS 17.0软件分析处理试验数据。试验数据表示为“平均值±标准偏差”的形式，显著性差异设置水平为P=0.05。

2 结果与讨论

2.1 酸浆水的酸度和pH

由图1、2可知，在单菌种发酵模式下，解淀粉乳杆菌L5和L6均可发酵豆腐黄浆水产酸，其中L6的产酸更强，而阿米塞毕赤氏酵母Y基本不产酸。解淀粉乳杆菌L5、L6在发酵豆腐黄浆水初期的12 h内(35℃)，菌种处于对数生长期，产酸能力强，pH值下降快，随着发酵时间的延长，产酸速率有所下降，L5在发酵48 h时产酸量达到最大，其后趋于平稳;L6的产酸能力更强，酸度值一直处于上升的趋势，在发酵60 h后酸浆的pH为3.74，酸度值达到65.11oT。由此可见，这2株解淀粉乳杆菌在没有补充任何营养成分的情况下［5］，能够在豆腐黄浆水中迅速生长产酸，具有很好的应用前景。对于乳酸菌而言，pH值下降可能是菌株代谢活性和生长的需要［13］，但对于酸浆水来说，pH值的下降可以抑制腐败菌和病原微生物的生长［5］，对酸浆的安全性具有重要意义。

图1 酸浆水的酸度值Figure 1 The titratable acidity of fermented tofu whey

图2 酸浆水的pH值Figure 2 The pH of fermented tofu whey

由于阿米塞毕赤氏酵母不产酸，因此L5+Y以及L6+Y这样的双菌种组合发酵豆腐黄浆水的产酸能力下降是可以理解的。但值得关注的是，L5+L6+Y这样3个菌株的组合在发酵豆腐黄浆水48 h时，其产酸仍然持续增加，接近或超过L5和L6的产酸能力，在发酵60 h时其酸度值达到65.44oT，超过单菌种发酵的酸度值，表明菌种L5和L6之间可能存在一种共生作用，需要进一步研究。

2.2 酸浆水的抗氧化活性

2.2.1 还原Fe3+的能力(FRAP) 在低pH条件下，抗氧化物质可以把复合物Fe3+—TPTZ还原为Fe2+—TPTZ，同时会显示深蓝色，在593 nm处有最大的吸收峰［10］，该FRAP方法快速、简单，结果重现性好，与抗氧化物质的摩尔浓度有较强的线性关系。由表1可知，在单菌株发酵模式下，豆腐黄浆水经解淀粉乳杆菌以及阿米塞毕赤氏酵母发酵后，其还原Fe3+的能力均显著增强;在组合发酵模式下，酸浆水还原Fe3+的能力优于单菌种发酵模式，其中L5+L6+Y组合发酵制备的酸浆水拥有最强的还原Fe3+能力，35℃发酵24 h后达到5.53 mmol Trolox/mL，此后继续发酵则还原Fe3+能力逐渐回落。由此可见，解淀粉乳杆菌及阿米塞毕赤氏酵母发酵豆腐黄浆水均可显著增强其还原能力。

表1 酸浆水还原Fe3+的能力Table 1 Iron(III)-reducing power of fermented tofu whey (mmol Trolox·mL－1)

表1 酸浆水还原Fe3+的能力Table 1 Iron(III)-reducing power of fermented tofu whey (mmol Trolox·mL－1)

不同大写字母表示同行数据之间差异显著(P＜0.05);不同小写字母表示同列数据之间差异显著(P＜0.05)。

时间样品0 h 24 h 48 h L5 4.56 ±0.05Ca 4.68 ±0.04Bd 4.99 ±0.06Ad L6 4.76 ±0.11Ba 4.93 ±0.05Ac 5.02 ±0.05Ad Y 4.71 ±0.08Ba 4.84 ±0.05Bc 5.14 ±0.10Ac L5+Y 4.58 ±0.01Ca 5.21 ±0.04Ab 5.10 ±0.04Bc L6+Y 4.70 ±0.08Ba 5.29 ±0.07Ab 5.22 ±0.05Ab L5+L6+Y 4.66 ±0.11Ba 5.53 ±0.06Aa 5.44 ±0.06Aa

从已有的报道［13－16］来看，很多菌种都可以通过发酵作用增强豆类制品的抗氧化能力，如黑豆经过曲霉、芽孢杆菌和酵母发酵后其还原Fe3+的能力明显提高［14］，鹰嘴豆经冬虫夏草发酵后其还原Fe3+的能力也明显提高［15］。Vadivel等［16］认为还原Fe3+能力的增加与总的游离多酚物质含量增加有关，游离多酚含量越高，生成的Fe2+—TPTZ复合物越多。Xiao等［13］的研究发现，当应用植物乳杆菌发酵豆腐黄浆水时，酸浆水中苷元型异黄酮含量以及总酚明显增加，且其还原Fe3+的能力也明显增强。由此可见，解淀粉乳杆菌和阿米塞毕赤氏酵母可能都有释放游离酚的能力。

2.2.2 酸浆水清除DPPH自由基能力 由表2可知，在单菌种发酵模式下，解淀粉乳杆菌发酵豆腐黄浆水对增强清除DPPH自由基能力没有显著效果，但豆腐黄浆水经过阿米塞毕赤氏酵母Y发酵以后，清除DPPH自由基能力显著提高，拥有最强的清除DPPH自由基能力，35℃发酵48 h后，达到38.49 μmol Trolox/mL;在多菌种组合发酵模式下，酸浆水清除DPPH自由基的能力均有所增强，且随着发酵时间的延长，清除能力增强，其中，L5+Y组合发酵制备的酸浆水拥有较强的清除DPPH自由基的能力。综合比较，解淀粉乳杆菌对提高豆腐黄浆水清除DPPH自由基的能力不显著，阿米塞毕赤氏酵母发酵豆腐黄浆水能够显著提高其清除DPPH自由基的能力，多菌种组合发酵模式下清除能力有所下降。

表2 酸浆水清除DPPH自由基的能力Table 2 DPPH radical scavenging activities of fermented tofu whey (μmol Trolox·mL－1)

不同大写字母表示同行数据之间差异显著(P＜0.05);不同小写字母表示同列数据之间差异显著(P＜0.05)。

时间样品0 h 24 h 48 h L5 32.38 ±0.10Ac 32.22 ±0.18Ae 31.84 ±0.06Bf L6 32.64 ±0.05Bc 32.80 ±0.10ABd 32.95 ±0.13Ae Y 34.19 ±0.08Ca 36.65 ±0.14Ba 38.49 ±0.14Aa L5+Y 34.03 ±0.15Ba 34.20 ±0.18Bb 36.54 ±0.20Ab L6+Y 33.31 ±0.14Cb 33.82 ±0.14Bc 34.94 ±0.17Ad L5+L6+Y 33.49 ±0.08Cb 34.11 ±0.14Bb 35.87 ±0.08Ac

有研究［17］指出，清除DPPH自由基的能力与化学物质自身的组成和结构有很大关系，分子大小合适、含有羟基基团、能够提供电子的抗氧化物质，可以快速地清除DPPH自由基。陈历水等［18］的研究表明，毕赤氏酵母细胞具有较好的清除DPPH自由基能力;酵母细胞本身所含有的抗氧化物质(如SOD酶和CAT酶等)、分泌的一些能抑制氧化的物质以及其细胞壁上的多糖蛋白均具有较好的抗氧化能力［19］。

2.2.3 螯合Fe2+的能力 有研究［20］表明，过渡金属参与生物体内的多种氧化反应，如Fe2+可以诱导超氧阴离子形成危害更大的羟基自由基，通过抗氧化物质螯合金属离子被认为是清除羟基自由基最有效的方式。由表3可知，在单菌种发酵模式下，L6和Y发酵制备的酸浆水对Fe2+的螯合能力随着发酵时间的延长而增强，其中L6发酵制备的酸浆水表现出最强的螯合Fe2+能力，螯合率达到54.45%。值得关注的是，L5虽然也是解淀粉乳杆菌，但其发酵制备的酸浆水螯合Fe2+的能力却随着发酵时间的延长而降低，表现出与L6完全不同的结果。在多菌种组合发酵模式条件下，L5+L6+Y发酵制备的酸浆水的螯合力并不比L6+Y发酵制备的酸浆水螯合力差，表明L6和L5之间可能有某种共生或互生关系。螯合Fe2+能力的强弱与化合物的结构有很大的关系，结构中含有两个或多个羟基、羰基、巯基、羧基等官能团时，螯合金属离子的能力会显著增强［17］，解淀粉乳杆菌L6和L5在螯合Fe2+方面表现出的截然不同的能力有待进一步的研究，可能与这两个菌种对豆腐黄浆水中抗氧化物质的生物转换能力不同有关。

表3 酸浆水螯合Fe2+的能力Table 3 Iron(II)-chelating power of fermented tofu whey Chelation rate %

表3 酸浆水螯合Fe2+的能力Table 3 Iron(II)-chelating power of fermented tofu whey Chelation rate %

不同大写字母表示同行数据之间差异显著(P＜0.05);不同小写字母表示同列数据之间差异显著(P＜0.05)。

时间样品0 h 24 h 48 h L5 35.33 ±1.53Aa 21.54 ±0.25Bf 15.11 ±0.21Ce L6 34.95 ±0.30Cab 51.21 ±0.18Ba 54.45 ±0.36Aa Y 34.72 ±0.86Bab 38.72 ±0.45Ac 39.00 ±0.25Ac L5+Y 35.46 ±0.32Aab 31.35 ±0.30Be 24.56 ±0.43Cd L6+Y 34.32 ±1.02Cb 36.44 ±0.60Bd 44.75 ±0.85Ab L5+L6+Y 34.31 ±0.18Bb 44.33 ±0.23Ab 44.17 ±0.24Ab

综合抗氧化试验结果，豆腐黄浆水本身就具有抗氧化能力，这主要是由于豆腐黄浆水中富含异黄酮、小分子蛋白、低聚糖等抗氧化成分，而发酵作用可促进糖苷型大豆异黄酮转化为活性更强的游离苷元型大豆异黄酮，从而提高酸浆水的抗氧化活性［13］，不过，不同的菌种在抗氧化能力方面表现出较大的差异。

由于解淀粉乳杆菌L5和L6发酵豆腐黄浆水具有优越的产酸能力，同时L5+L6+Y组合发酵制备的酸浆水具有良好的抗氧化活性，因此，不仅可以利用解淀粉乳杆菌和阿米塞毕赤氏酵母发酵制备豆腐凝固剂，也可以利用这种发酵作用制备风味良好的功能性饮料。

3 结论

(1)解淀粉乳杆菌L5和L6均可在天然的豆腐黄浆水中生长产酸，其中菌株L6的发酵产酸能力更强，35℃发酵60 h后，酸度达到65.11oT，此外，3个菌株组合发酵时也有较强的产酸能力，在发酵60 h后，酸度也达到65.44oT，可根据生产实际选择不同的菌种来制备豆腐凝固剂。

(2)豆腐黄浆水经过解淀粉乳杆菌L6发酵后，还原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力略有增加，但螯合Fe2+的能力显著增强，在发酵48 h时达到54.45%;与L6不同，解淀粉乳杆菌L5发酵制备的酸浆水螯合Fe2+的能力随着发酵时间延长而明显下降;阿米塞毕赤氏酵母Y发酵制备的酸浆水具有良好的还原Fe3+的能力、清除DPPH自由基的能力以及螯合Fe2+的能力;当3个菌株组合发酵时，其产酸能力以及酸浆水还原Fe3+的能力、清除DPPH自由基的能力和螯合Fe2+的能力均比L6+Y双菌株发酵制备的酸浆水强，菌株之间可能有一定的相互促进作用。

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