多药耐药相关蛋白2基因在COC1/DDP细胞对顺铂耐药中的作用

张　珂，张　霞，孙彩萍，胡　滨

(郑州大学第二附属医院妇产科，河南 郑州 450014)

多药耐药相关蛋白2基因在COC1/DDP细胞对顺铂耐药中的作用

张珂，张霞，孙彩萍，胡滨

(郑州大学第二附属医院妇产科，河南 郑州 450014)

[摘要]目的观察顺铂耐药卵巢癌细胞系COC1/DDP中多药耐药相关蛋白2(MRP2)基因的表达，探讨其反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对COC1/DDP顺铂耐药的逆转作用。方法设计合成针对MRP2的ASODN，以200 nmol·L-1浓度转染COC1/DDP细胞，用四甲基偶氮唑蓝法观察顺铂对细胞抑制率的影响，逆转录PCR检测MRP2基因表达水平的变化。结果COC1/DDP细胞中MRP2基因呈高表达，其mRNA相对表达值为0.420 0±0.050 0，而COC1细胞中无表达。与COC1/DDP组比较，MRP2-ASODN组MRP2基因低表达，mRNA相对表达值为0.018 7±0.023 0，耐药指数降低为4.58，差异均有统计学意义(P<0.05)；SODN组MRP2表达及耐药指数改变差异均无统计学意义(P>0.05)。结论MRP2基因高表达与COC1细胞获得顺铂耐药性有密切关系；MRP2-ASODN能有效逆转COC1/DDP细胞对顺铂的耐药性。

[关键词]卵巢肿瘤；顺铂；反义寡核苷酸；多药耐药性

如何逆转特别是在基因水平逆转卵巢癌对顺铂耐药是临床医生关注的热点。反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)技术是指用一段人工合成的能与mRNA互补结合的DNA单链来抑制基因的表达。我们观察了人多药耐药相关蛋白2(multi-drug resistance related protein-2，MRP2)基因在卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP与其亲代细胞间表达的差异。并设计合成相应的ASODN抑制其表达，观察细胞耐药性的改变，为临床逆转顺铂耐药提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料人卵巢癌细胞系COC1及顺铂耐药卵巢癌细胞系COC1/DDP购自武汉大学中国典型培养物保藏中心；顺铂购自山东齐鲁制药厂；脂质体Oligofectamin购自美国Invitrogen 公司；抗人MRP2小鼠单克隆抗体购自深圳晶美公司；四甲基氮唑蓝购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；第一链cDNA合成试剂盒购自深圳晶美公司；PCR反应试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.2细胞中MRP2基因的表达使用逆转录PCR法测定(转染前后细胞均行测定，所有研究至少重复3次)细胞中MRP2基因的表达。MRP2引物由上海博亚生物技术有限公司合成。MRP2(453 bp)上游引物序列 5’-GGAACAATTGTAGAGAAAGGATC-3’，下游引物序列 5’-CACAAACGCAACGATGATGAAGAA-3’；内参照β-actin(317 bp)上游引物序列 5’-GTGGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’；下游引物序列5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。

1.3细胞转染针对MRP2的ASODN及错义寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide，SODN)由北京赛百胜公司合成。其序列如下：MRP2-ASODN：3’-TCAGGTCCTTAGTACGA-5’；SODN: 5’-AGTAGGCTTGCCTGGCAG-3’。测定的细胞分为3组(MRP2-ASODN组、COC1/DDP组、SODN组)。参考脂质体Oligofectamin说明书制备脂质体寡核苷酸复合物后转染COC1/DDP细胞，MRP2-ASODN及SODN浓度为200 nmol·L-1。每组复设4孔。

1.4细胞生长抑制率及耐药指数测定接种3组细胞于96孔板，加入不同浓度的顺铂(0.5、1、2、2.5、5、10、20、40 μg·mL-1)20 mL，各浓度设3个平行孔，空白孔加入PBS。孵育48 h后每孔加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL，孵育4 h，离心振荡后测定吸光度A值。细胞存活率=实验孔A值/对照孔A值×100%。细胞生长抑制率=(对照组平均吸光度A值-加药组平均吸光度A值)/对照组平均吸光度A值×100%。半效抑制量(IC50)应用SPSS 13.0进行Probit回归后求得。耐药指数(RI)=耐药细胞株IC50/敏感细胞株IC50。

1.5统计学处理采用SPSS 13.0分析数据，计量资料用±s表示，比较采用t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1细胞中MRP2基因的表达COC1细胞中MRP2基因呈阴性表达，COC1/DDP细胞中MRP2 mRNA相对表达值为0.420 0±0.050 0。COC1细胞IC50值为(0.79±0.06)μg·mL-1，COC1/DDP细胞为(5.62±0.13)μg·mL-1，RI为7.20。见图1。

图1　不同细胞中MRP2基因的表达

1:COC1中β-actin；2:COC1/DDP中β-actin；3:COC1中MRP2；4:COC1/DDP中MRP2

2.2转染前后细胞中MRP2的mRNA表达的改变MRP2-ASODN组、SODN组MRP2 mRNA相对表达值分别为0.018 7±0.023 0(与COC1/DDP组的0.370 0±0.008 6比较差异有统计学意义，P<0.05)、0.398 5±0.033 1(与COC1/DDP组比较差异无统计学意义，P>0.05)。MRP2-ASODN组与SODN组比较差异有统计学意义(P<0.05)。转染MRP2-ASODN能显著降低COC1/DDP细胞中MRP2的表达。见图2。

图2　转染前后细胞中MRP2的mRNA表达的改变

1:MRP2-ASODN组β-actin；2:SODN组β-actin；3:COC1/DDP组β-actin；4:MRP2-ASODN组MRP2；5:SODN组MRP2；6:COC1/DDP组MRP2

2.3转染前后细胞耐药性的改变与COC1/DDP组比较，MRP2-ASODN组的细胞IC50值下降了35.6%，为(3.62±0.29)μg·mL-1，RI为4.58(P<0.05)；SODN组的细胞IC50值略有降低，为(5.64±0.21)μg·mL-1，RI为7.14(P>0.05)。与SODN组比较，MRP2-ASODN组的细胞IC50值及RI均有明显降低，比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4转染前后细胞抑制率的改变转染相应基因的ASODN能显著增加顺铂对耐药细胞的抑制率。见图3。

图3　转染前后细胞抑制率的改变

3讨论

MRP2属于ABC蛋白超家族[1]，是广泛存在于细胞膜上的能量依赖性转运蛋白，在细胞内主要负责转运多种药物以及阴离子化合物等物质。在肿瘤对顺铂耐药的产生过程中，细胞内药物聚集浓度的降低起着重要的作用[2]。研究[3]证明MRP2在体内具有转运多种抗肿瘤药物的功能。国内外对于MRP2是否导致肿瘤顺铂耐药进行了大量的研究，但至今尚无定论。Materna 等[4]对卵巢癌、肾上腺皮质肿瘤以及黑色素瘤细胞的研究发现3种对顺铂耐药的肿瘤细胞中MRP2均呈高表达状态，其后针对MRP2基因设计了特异性核酶以封闭基因的表达，转染后明显降低了3种细胞的顺铂的耐药性。曾晓勇等[5]对于膀胱癌的研究认为MRP2的表达与膀胱癌对顺铂的耐药性并不相关。

ASODN属于反义寡核苷酸技术的一种，利用体外合成的单链DNA分子通过与mRNA的特异性结合从而抑制目的基因的表达。Stöckel等[6]对MRP2基因的研究表明核苷酸序列-517和-197对MRP2的基础表达是决定性的。本研究将MRP2-ASODN序列设计在该区间的成环区，BLAST同源分析与人MRP2基因高度同源，符合寡核苷酸的设计原则。

我们应用MRP2-ASODN转染COC1/DDP细胞，显著降低了该基因mRNA的表达，因此本研究所设计的ASODN可以特异性作用于靶基因，在转录水平抑制其表达。同时，本研究采用阳离子脂质体包裹ASODN提高了转染效率。

本研究结果证实了MRP2在COC1/DDP细胞对顺铂耐药产生中的作用，为应用反义寡核苷酸逆转肿瘤耐药提供了可能，并为寻找卵巢癌临床有效的化疗方案提供了参考。

参考文献：

[1]Taniguchi K, Wada M, Kohno K, et al.A human canalicular multispecific organic anion transporter (cMOAT) gene is overexpressed in cisplatin-resistant human cancer cell lines with decreased drug accumulation[J].Cancer Res, 1996, 56(18):4124-4129.

[2]Siddik ZH.Cisplatin: mode of cytotoxic action and molecular basis of resistance[J].Oncogene,2003,22(47):7265-7279.

[3]Cui Y, König J, Buchholz JK, et al.Drug resistance and ATP-dependent conjugate transport mediated by the apical multidrug resistance protein, MRP2, permanently expressed in human and canine cells[J].Mol Pharmacol, 1999,55(5):929-937.

[4]Materna V, Liedert B, Thomale J, et al.Protection of platinum-DNA adduct formation and reversal of cisplatin resistance by anti-MRP2 hammerhead ribozymes in human cancer cells[J].Int J Cancer, 2005,115(3):393-402.

[5]曾晓勇,杨为民,叶章群,等.γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和多药耐药相关蛋白基因在膀胱癌中的表达及相关性分析[J].华中科技大学学报:医学版, 2002,31(6):649-652.

[6]Stöckel B, König J, Nies AT, et al.Characterization of the 5’-flanking region of the human multidrug resistance protein 2 (MRP2) gene and its regulation in comparison withthe multidrug resistance protein 3 (MRP3) gene[J].Eur J Biochem, 2000, 267(5):1347-1358.

作者简介：张珂(1979-)，女，硕士，主治医师，主要从事妇科肿瘤的基础与临床研究。E-mail：kkxxzj@126.com 吴晓翠(1964-)，女，副主任医师，主要从事肿瘤放疗相关研究。E-mail：wangmamamm@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.001

[中图分类号]R737.31；R730.53

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5412(2015)05-0369-03

(收稿日期：2015-06-12)

基金项目：国家临床重点专科建设项目

通信作者：孟辉(1973-)，女，博士，副主任医师，主要从事肿瘤发生机制研究。E-mail：menghuidrch@163.com

Effect of Multi-drug Related Protein-2 in the
Cisplatin Resistance of COC1/DDP Cells

Zhang Ke, Zhang Xia, Sun Caiping, Hu Bin

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecond

AffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China)

[Abstract]ObjectiveTo study the expression of multi-drug resistance related protein-2 (MRP2) of COC1/DDP cell line, and the reversion of cisplatin resistance by antisense oligodeoxynucleotide (ASODN).MethodsThe ASODN targeting MRP2 was designed and synthesized.The ASODN targeting MRP2 with the concentration of 200 nmol·L-1was transferred into COC1/DDP cells by lipofectin.The inhibition rate of transferred cells to cisplatin was detected with MTT assay.The altered expression of MRP2 was detected by reverse transcription PCR.ResultsMRP2 were overexpressed in cisplatin resistant cell line of COC1/DDP compared with COC1 cell line.Compared with the COC1/DDP cell group, MRP2 expression in the MRP2-ASODN transfected cell group was significantly decreased to 0.018 7±0.023 0, and the resistance index was 4.58 (P<0.05); there were no difference in the MRP2 expression and resistance index between the COC1/DDP cell group and the SODN group (P>0.05).ConclusionThe overexpression of MRP2 may play an important role in the induction of resistance of COC1/DDP cells to cisplatin; MRP2-ASODN can effectively reverse the resistance of COC1/DDP cells to cisplatin and increase their drug sensitivity in a sequence specific manner.

[Key words]ovarian neoplasms; cisplatin; antisense oligodeoxynucleotide; multi-drug resistance