高效液相色谱法测定4种肿瘤细胞内2-甲氧基雌二醇含量

李银英，刘　宇，张振中

(1. 郑州大学第二附属医院西药学部，河南 郑州 450014；2. 郑州大学药学院，河南 郑州 450001)

高效液相色谱法测定4种肿瘤细胞内2-甲氧基雌二醇含量

李银英1，刘宇1，张振中2

(1. 郑州大学第二附属医院西药学部，河南 郑州 450014；2. 郑州大学药学院，河南 郑州 450001)

[摘要]目的建立肿瘤细胞内2-甲氧基雌二醇含量的测定方法，并测定不同时间、不同细胞系对2-甲氧基雌二醇的吸收情况。方法给予肿瘤细胞含有2-甲氧基雌二醇的培养基，固定时间点收集细胞，细胞破碎液进行液-液萃取，采用反相高效液相色谱法测定2-甲氧基雌二醇含量。结果所选择的4种肿瘤细胞系最高吸收值均在2 h，不同细胞系对药物的吸收量略有差别。结论该方法准确、操作简单、灵敏度高，适合用于肿瘤细胞内2-甲氧基雌二醇含量的测定。

[关键词]2-甲氧基雌二醇；肿瘤细胞；吸收；高效液相色谱法

2-甲氧基雌二醇是17β-雌二醇的内原性代谢产物，但其却不与雌激素受体结合。近几年研究[1]发现2-甲氧基雌二醇具有良好的抗肿瘤活性，能够在无临床毒副反应的剂量内抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞的凋亡。另外，虽然2-甲氧基雌二醇已经进入到乳腺癌、前列腺癌等实体瘤的临床Ⅰ、Ⅱ期研究，但临床治疗效果并不令人满意，主要是因为其在靶部位或是血浆中不能持续维持有效浓度[2-4]。然而国内外对2-甲氧基雌二醇及其制剂的研究主要集中在抗肿瘤机制的研究[5]，尚未见有关其细胞药物吸收，药物含量方面的研究报道，因而我们针对该方面进行初步研究。

1材料与方法

1.1仪器AgilentlZoo/1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，Agiteni荧光(美国Agilent公司)，AgilentlZoo化学工作站(美国Agilent公司)，MD200-2型氮气吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)，JY92-11超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，DJ-200J电子天平(ATAY公司)，AB135-S分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，分析柱phenomenex luna 5u C18(2)(250 nm×4.60 nm)等。

1.2药品与试剂2-甲氧基雌二醇对照品(郑州大学药学院自制，纯度99.1%，批号：20091105)，甲醇(天津四友精细化学品有限公司，色谱纯)，其他试剂均符合常规标准。

1.3细胞系前列腺癌PC-3细胞系，肝癌HEPG-2细胞系，胃癌SGC-7901细胞系，乳腺癌细胞系MCF-7。

1.4试剂的配制2-甲氧基雌二醇标准溶液的配制：称取1 mg 2-甲氧基雌二醇于10 mL容量瓶内，用甲醇：水(75:25)混合溶剂定容摇匀，即得100 μg·mL-1的2-甲氧基雌二醇储备液，再用甲醇水(7525)的混合溶剂倍比稀释成浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg·mL-1的系列标准溶液备用。

质控样品2-甲氧基雌二醇溶液的配制：用标准曲线中高、中、低3种浓度中的每2个浓度等体积混合可得37.5、9.375、2.343 75 μg·mL-1的系列标准溶液。

细胞用2-甲氧基雌二醇溶液的配制：称取2-甲氧基雌二醇，用DMSO溶解成10 mg·mL-1溶液，用于细胞时，用RPMI-1640培养基稀释成4.5 μg·mL-1的所需浓度。

1.5方法

1.5.1细胞破碎液制备细胞用含有胎牛血清(体积分数10%)、双抗(1%)的RPMI-1640培养基在37 ℃、含体积分数5% CO2的孵箱中培养，相同量传代于培养瓶中，待细胞密度达70% ～ 80%时，实验组加入含2-甲氧基雌二醇4.5 μg·mL-1的RPMI-1640培养基，分别于0.5、1、2、4、6 h定量收集细胞，并用PBS溶液洗涤2次，再用1 mL的PBS悬浮细胞使之成为1×106个/mL的细胞悬液，并转移于5 mL EP管中；收集的细胞悬液用超声波细胞粉碎机进行破碎(工作6 s，间歇8 s，200 W超声25次)。

1.5.2样品处理向细胞破碎液中加入提取试剂乙酸乙酯3 mL涡旋5 min；10 000 rpm离心10 min，取上层有机相于45 ℃下空气吹开，残留物于适量的甲醇：水(75:25)中涡旋溶解，10 000 rpm离心10 min后，吸取上层澄清液20 μL进样测定。

1.5.3色谱条件色谱柱：phenomenex luna 5u C18(2)(250 nm×4.60 nm)；流动相：甲醇水(7525)；流速：0.75 μL·min-1；激发波长：288 nm，发射波长：325 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析，所得计量数据采用计量资料用±s表示，2组间比较用t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.1专属性在所选择的色谱条件下，细胞代谢物等对2-甲氧基雌二醇的含量测定基本无干扰；2-甲氧基雌二醇的出峰时间约为9.4 min左右，分离效果见图1。

图1　2-甲氧基雌二醇色谱图

2.2标准曲线和定量下限精密量取不同浓度的2-甲氧基雌二醇标准溶液各10 μL，45 ℃空气挥尽溶媒，加入1 mL空白细胞破碎液，配制成15.625、31.25、62.5、125、250、500 ng·mL-1溶液，按前述方法进行处理，以2-甲氧基雌二醇峰面积对浓度进行线性回归，得曲线的回归方程为：A=1.230 1C-13.973(r2=0．999 1)表明在15.625～500 ng·mL-1范围内线性良好，方法定量下限约是15 ng·mL-1。

2.3准确度与精密度精密量取不同浓度的2-甲氧基雌二醇标准溶液各10 μL，45 ℃空气挥尽溶媒，加入细胞破碎液1 mL，准确配制低、中、高3个浓度分别为23..437 5、93.75、375 ng·mL-1的质量控制样品各5份，连续配制、测定3 d，用以考查准确度、日内精密度及日间精密度。见表1。

表1　准确度与精密度

2.4提取回收率按照前述方法制备标准曲线及质量控制样品；另取10 μL与质量控制样品浓度相同的标准溶液用流动相，即甲醇水(7525)分别稀释至1 mL。同法20 μL进样测定。用质量控制测得的峰面积与未经提取的相同浓度溶液测得的峰面积作比，用以考查该方法的提取回收率。结果3种浓度下2-甲氧基雌二醇的提取回收率分别是(84.345 0±5.889 2)%、(88.147 0±2.368 7)%、(92.552 7±2.597 4)%。根据提取回收率70%是一般认为有较好的提取回收率，而80%～90%则被大多数人认为是一个可接受的限度[6]；可知本方法的提取回收率是可接受的。

2.5稳定性按前述方法制备3个浓度的质量控制样品，吹干后密封于-20 ℃冰箱保存3 d，再复溶，20 μL进样测定；进样当天同法配制质量控制样品，按前述方法配制标准曲线并同法测定。将2种质量控制样品测定值进行比较。见表2。

表2　稳定性实验结果

注：由于冻存质量控制样品测定值在新配置质量控制样品测定值5%范围内认为有较好的稳定性[6]，提示该测定值符合要求

2.6方法学评价及药物含量测定结果分析方法评价结果表明，该方法有较好的专属性，准确度、精密度、提取回收率、稳定性均能达到分析要求，说明该方法用于细胞内2-甲氧基雌二醇含量测定是可行的。

采用该方法对4种不同细胞，不同时间药物含量进行测定，实验结果显示，对4种不同肿瘤细胞加入同浓度2-甲氧基雌二醇原料药，均在2 h时出现最大吸收，且总体上SGC-7901胃癌细胞吸收最好，其次依次为PC-3前列腺癌细胞、MCF-7乳腺癌细胞、HEPG肝癌细胞。见图2。

图2　不同肿瘤细胞系不同药物作用时间2-甲氧基雌二醇含量

3讨论

虽然国内外有文献[7-9]建立了人体血浆中2-甲氧基雌二醇含量的测定方法，但是对细胞内2-甲氧基雌二醇的含量的测定还鲜有报道。在此我们建立了一种简便、快速的测定细胞内2-甲氧基雌二醇含量的测定方法，该方法具有良好准确度、精密度及大多数人认可的提取回收率，并且有良好的稳定性。因而该方法可用于细胞内2-甲氧基雌二醇含量测定。并可以结合其他方法结合近一步说明2-甲氧基雌二醇及其制剂的作用机制。

参考文献：

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[3]James J, Murry DJ, Treston AM, et al. Phase Ⅰ safety, pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of 2-methoxyestradiol alone or in combination with docetaxel in patients with locally recurrent or metastatic breast cancer[J]. Invest New Drugs, 2007,25(1):41-48.

[4]Garcia GE, Wisniewski HG, Lucia MS, et al. 2-Methoxyestradiol inhibits prostate tumor development in transgenic adenocarcinoma of mouse prostate: role of tumor necrosis factor-alpha-stimulated gene 6[J].Clin Cancer Res,2006,12(3 Pt 1):980-988.

[5]刘颖.2-甲氧基雌二醇的研究进展[J].哈尔滨医药，2011,31(3)：212-213.

[6]李好枝.体内药物分析[M].中国医药科技出版社，2004：120-132.

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[8]李杨,张青青,孙惠斌,等.2-甲氧基雌二醇大鼠血浆蛋白结合率的测定[J].中国新药与临床杂志，2011,30(10)：755-758.

[9]Lakhani NJ, Lepper ER, Sparreboom A, et al. Determination of 2-methoxyestradiol in human plasma, using liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2005，19(9):1176-1182.

DOI:10.3969/j.issn.1673-5412.2015.05.004

[中图分类号]R979.1

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5412(2015)05-0380-04

(收稿日期：2015-03-10)

High Performance Liquid Chromatography in the
Detection of 2-methoxyestradiol in Different Tumor Cell Lines

Li Yinying1,Liu Yu1,Zhang Zhenzhong2

(1.WesternMedicineDivision,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014,China;

2.DepartmentofPharmacy,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for determination the 2 - methoxyestradiol in cells, and to measure the absorption of 2-methoxyestradiol during different times, in different cell lines.MethodsThe medium containing 2-methoxyestradiol were given into cells, the cells were collected at fixed times, cell lysate was used to liquid-liquid extraction. Reversed-phase high performance liquid chromatography method was used to determine the contention of 2-methoxyestradiol.ResultsHighest absorption value of the four selected cell lines was 2 h, the drug uptake in different cell lines was slightly different.ConclusionThe method is accurate, simple operation, high sensitivity, suitable for the determination of 2-methoxyestradiol contention in tumor cell lines.

[Key words]2-methoxyestradiol; tumor cells; absorption; high performance liquid chromatography