壳聚糖修饰碳纳米管载药体系的制备及性状的考察

作者单位：450016郑州市第七人民医院药学部



壳聚糖修饰碳纳米管载药体系的制备及性状的考察

李艳凤 关 动

作者单位：450016郑州市第七人民医院药学部

【摘要】目的 构建难溶性药物具有肿瘤靶向性，缓释性的转运载体。方法 用混酸将碳纳米管切断并氧化，后用天然多糖壳聚糖进行修饰，提高其生物相容性，然后利用壳聚糖分子中的氨基与叶酸分子中羧基进行酰胺化的反应，得到具有靶向的药物载体，最后连接上难溶性的抗肿瘤药物2-甲氧基雌二醇。结果 成功制备2-ME-FA-CHI-SWNTs肿瘤靶向药物载运系统。结论 制备的载药体系比较稳定，粒径电位较理想。

【关键词】碳纳米管；壳聚糖；叶酸；2-甲氧基雌二醇

2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）为体内雌二醇的代谢产物，对多种肿瘤细胞具有抑制作用，不良反应发生率小［1］。但2-ME是一种难溶性药物，胃肠道吸收差，血浆消除率快，生物利用度低。所以如何提高该药物溶解度，并使其在体内达到一个长期有效的血药浓度是该药物研究的重难点。

靶向给药系统是利用具有一定特异性的载体将药物定向作用于肿瘤组织， 而不影响正常组织细胞功能， 从而提高疗效、减少毒副作用的一种给药系统［2］。该系统中以碳纳米材料中的碳纳米管（SWNTs）为代表，在生物医药领域的应用得到广泛研究。碳纳米管具有细胞膜穿透性并具有较高的药物负载率，它的稳定性和结构柔性还可延长循环时间并改进结合的药物分子的生物利用度［3］。但原始碳纳米管不能溶解于生理体液中，容易聚集在细胞、器官和组织中［4］。本研究用壳聚糖（Chitosan，CHI）对碳纳米管表面进行修饰，改善了其溶解性和生物相容性。有引入叶酸（Folic acid，FA）作靶向因子，最后将2-ME负载于碳纳米管侧壁，构建了难溶性药物具有肿瘤靶向性的转运体系。

1　实验仪器及试剂

UV-2102型紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；Nano-ZS90型激光粒度分析仪（英国马尔文公司）；DSC/TGA同步分析仪Q600（日本岛津）；碳纳米管（中国科学院成都有机化学研究所）；壳聚糖（脱乙酰度≥95%）（东京化成公司）；叶酸 （国药集团化学试剂有限公司）；2-甲氧基雌二醇（纯度：99%）（郑州大学药学院）。

2　实验步骤

2.1 碳纳米管的酸化

取适量原始碳纳米管（r-SWNTs）加入到适量混酸（浓H2SO4/HNO3体积比 3:1）中，超声对碳纳米管进行酸化，冷却至室温后，加入一定量超纯水稀释，微孔滤膜过滤，得到的黑色固体用超纯水洗至中性，最后将样品真空干燥过夜，得酸氧化后碳纳米管（p-SWNTs）。

2.2 壳聚糖对碳纳米管的表面修饰

将适量壳聚糖经自然溶胀过程溶于2%冰醋酸溶液中，加入等量酸化后的SWNTs，超声0.5 h，磁力搅拌过夜，离心洗涤除去游离的壳聚糖。经超声重悬于一定量PH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。

2.3 叶酸的连接

取一定量FA和EDC•HCL，加入适量PBS溶液中，超声混合均匀后，避光磁力搅拌得到叶酸活化酯。然后将CHI-SWNTs的PBS混悬液和叶酸活化酯溶液混合，继续避光磁力搅拌过夜。离心弃上清，用PH 7.4的PBS溶液避光透析三天，定时换透析液，通过紫外分光光度计对所换的透析液进行测定，确定游离叶酸的含量，然后将透析液换为超纯水再透析三天，除去水溶性杂质，纯化产物。最后将透析袋中的保留液取出，避光冷冻干燥得叶酸修饰的碳纳米管粉末（FA-CHI-SWNTs）。

2.4 2-ME 的负载

称取一定量FA-CHI-SWNTs冻干粉和2-ME置于棕色瓶内，加入2 ml甲醇，超声溶解，然后在冰水浴超声条件下，逐滴加入8 ml超纯水，继续超声2 h，后探超，离心弃上清，沉淀超声重悬后再离心，取上层液得制剂2-ME-FA-CHI-SWNTs，为黑色的混悬液，避光放置无分层沉淀，进行冷冻干燥得固体粉末。

2.5 性状的检测

分别从水溶性、热重分析（TGA）、紫外可见分光光谱（UV）、粒径和电位及自动插式扫描量热曲线（DSC）对载药体系的性状进行考察。

3　实验结果与讨论

3.1 水溶性考察

原始碳纳米管为水不溶性，放置后分层沉淀；酸化碳纳米管，水溶性有所改善，放置后仍有沉淀，但无明显分层；壳聚糖修饰后碳纳米管在水中分散良好，呈黑色均一溶液，放置观察无分层沉淀。酸化碳纳米管由于带有羧基，呈负电，壳聚糖由于带有大量的氨基，呈正电。两者由静电引力而吸附在一起。碳纳米管的表面被壳聚糖包裹，水溶性大大提高，可均匀分散在水中且溶液稳定。

3.2 热重分析（TGA）

图1　热重分析（TGA）曲线图

由图1可知，酸化后碳纳米管的TGA曲线随温度的升高变化不大，在200～800℃范围内降解了10.2%，这主要是因为酸化后碳纳米管形成的热不稳定的羟基和羧基热降解所造成的，而单纯的壳聚糖则在200～300℃内快速降解，温度达到530℃时已完全降解。在200～800℃范围内，CHI-SWNTs降解了37%，由此可得出CHI在CHI-SWNTs产物中的质量分数为26.8%。

3.3 紫外可见分光光谱分析

图2　UV光谱图（A为p-SWNTs，B为CHI，C为CHI-SWNTs，D为FA-CHI-SWNTs）

由图2可知，酸化碳纳米管在249 nm处出现C=O的紫外特征吸收峰，表明碳纳米管酸化成功。壳聚糖本身的紫外吸收特别弱，因此C与A相比无明显变化，只有C=O的紫外特征吸收峰长移至257 nm。C与D对比FA-CHI-SWNTs在280 nm处出现了FA的紫外特征吸收，可见叶酸连接成功。

3.4 粒径和电位的考察

图3　制剂的粒径及电位扫描图谱

图3分别为2-ME-FA-CHI-SWNTs的粒径及电位，功能化碳纳米管的粒径及电位变化如表1所示。p-SWNTs有羧基带负电，CHI-SWNTs 有活性氨基变为正电，FA-CHI-SWNTs 因为FA上羧基，所以呈负电。靶向载体负载2-ME后，如图九所示电位（-26.4±2.3） mV，，能够在溶液中稳定存在。其粒径均分布在213 nm左右，符合制剂要求。

表1　功能化碳纳米管电位及粒径的变化

3.5 DSC曲线扫描

固态药物一般存在多种晶型，而不同晶型在溶解速率、生物利用度和药效上差别很大。高温稳定的晶型溶解速率比低温稳定的晶型快，药效明显易吸收，因此在制药过程中尽量使用高温稳定的晶型［5］。由图4可知，2-ME熔点峰为188℃左右，药物负载于碳纳米管之后，2-ME在188℃处熔点峰消失，取而代之在388℃处有峰出现。可见2-ME通过π-π堆积作用成功负载在碳纳米管上，且药物在载体材料中以高温稳定的晶型存在。

本研究成功制备了以碳纳米管为原材料的靶向给药载体，并以2-甲氧基雌二醇为模型药物进行载药，提高该药物溶解度，增加其选择性，以期在体内达到一个长期有效的血药浓度，为进一步研究打下良好基础。

图4　a为2-ME、b为2-ME与空白载体的物理混合粉末、c为制剂粉末的DSC曲线图

参考文献

［1］ Ricker J L， Chen Z，Yang X P， el a1．2-Methoxyestradiol inhibits hypoxia-inducible factor 1 alpha ， tumor growth ， and angiogenesis and augment paclitaxel efficacy in head and neck squamous cell carcinoma［J］．Clin Cancer ， 2004，10（24）：8665-8673.

［2］ 王宗花，周成凤，张菲菲，等.碳纳米管药物载体的研究进展［J］.材料导报，2011，25（7）：76-79.

［3］ Zhang X K，Meng LJ，LuQ H，et a1．Targeted delivery and controlled release of doxorubicin to cancer cells using modified single wall carbon nanotubes ［J］．Biomaterials，2009，30（30）：6041-6047.

［4］ 邬伟魁，张海燕，杨明，等.碳纳米管的载药及安全研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17（15）：261-264.

［5］ 范晓勇.替莫唑胺/紫杉醇复合缓释系统的构建及其抗胶质瘤性能的实验研究［D］.山东：山东大学，2011.

The Preparation and Properties of Targeted Delivery System of 2-ME-FA-CHI-SWNTs

LI Yanfeng GUAN Dong Seventh People’s Hospital of Zhengzhou city，Zhengzhou 450016，China

【Abstract】

Objective To prepare the targeted delivery system of 2-ME-FA-CHI-SWNTs. Methods Carbon nanotubes will be cut off and oxidated with mixed acid，modified with natural polysaccharides CHI to improve its biocompatibility and then connected with the target groups FA via the acylation reaction of the amino and carboxyl，finally loaded with the insoluble anticancer drug 2-ME. Results The targeted delivery syste -m of 2-ME-FACHI-SWNTs is successfully prepared. Conclusion The targeted delivery system of 2-ME-FA-CHI-SWNTs prepared by this method is relatively stable. The particle size and the Zeta are better.

【Key words】Carbon nanofubes，Chitosan，Folic Acid，2-methoxyestradio

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2015.26.073

【文章编号】1674-9316（2015）26-0100-03

【文献标识码】B

【中图分类号】R473.71