发酵时间对水豆豉理化特性和MCF-7人乳腺癌细胞体外抑制作用的影响

赵 欣 骞 宇

（重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067）

发酵时间对水豆豉理化特性和MCF-7人乳腺癌细胞体外抑制作用的影响

赵 欣 骞 宇

（重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067）

水豆豉是一种短时间发酵的黄豆制品，采用理化试验和癌细胞体外试验，通过pH、酸度、总菌数、氨基酸态氮含量、铵态氮含量、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）活性、感官评价、MTT试验和RT-PCR，评价不同发酵时间水豆豉的理化特性和体外抑制作用。随着发酵时间的增加，pH值和总菌数增加，发酵48 h水豆豉的蛋白质含量、酸度、γ-GTP和活性大豆异黄酮（大豆黄素和金雀异黄素）含量都比其他发酵时间水豆豉高，在感官评价上48 h发酵的水豆豉也优于其他发酵时间的水豆豉。48 h发酵的水豆豉也具有对MCF-7人乳腺癌细胞最强的生长抑制作用，且48 h发酵水豆豉处理后的MCF-7细胞的Bax，caspase 3，9基因的表达强于其他发酵时间的水豆豉，Bcl-2基因则弱于其他发酵时间的水豆豉。结果显示48 h发酵的水豆豉具有最好的理化品质和体外抗癌效果。研究结果为改善水豆豉生产工艺提供理论支持。

水豆豉 理化特性 发酵时间 MCF-7 人乳腺癌细胞 抗癌

豆豉是我国的黄豆传统发酵制品，味道鲜美可口，既能调味又能入药，传统中医认为豆豉性具有解表清热、透疹解毒的作用［1］，长期食用还可开胃增食、消积化滞、祛风散寒。水豆豉是细菌型豆豉，是由黄豆经过细菌发酵而成的酿造调味食品，其含水量比其他类型豆豉大，且在堆积发酵过程中能水解产生一些特殊气味［2］。水豆豉营养丰富，含有多种蛋白质，维生素和矿物质的含量也较高［3-4］。

发酵时间是影响发酵食品品质和功能性作用的重要因素，在提高酸菜、发酵酱类、醋和酱油等传统发酵食品品质的研究中，是研究的重点［5-8］。将黄豆浸泡后蒸煮熟，在26～45℃下发酵48～72 h，黄豆之间产生黏状丝后表示发酵完成，再加入盐、辣椒粉、花椒粉和植物油等调味料，低温保存1至2周，缓慢后发酵以增加香味［9］。大豆制品中含有多种功效成分，迄今，我国关于水豆豉对乳腺癌的生理功效的影响，特别是生产工艺与水豆豉抗乳腺癌的研究明显不足。MCF-7人乳腺癌复细胞作为一种代表性研究用细胞株已经被充分运用在食品功能性作用的研究中。本研究对不同发酵时间水豆豉的理化品质进行了量化比较，对发酵时间与人乳腺癌细胞体外抑制作用之间的关系进行了初步研究，为确定水豆豉最佳发酵时间，促进高品质水豆豉的科学生产及抗乳腺癌提供了一定的基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑龙江农垦总局大西江农场（黑龙江省嫩江县）产优质黄豆（拉丁名为Glycinemax），采收于2012年秋季，采用高湿度人工收获方式收获黄豆后自然日光晒干后低温密闭贮藏待用。

AM505-K铵态氮试剂盒、AM158-Kγ-谷氨酰转肽酶试剂盒：韩国Asan公司；D-生物素、L-组氨酸盐酸盐、D-葡萄糖-6-磷酸、NADP（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）、大豆黄素和金雀异黄素标准品、3-（4，5-二甲基噻唑 -2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT试剂）：美国Sigma公司；DMSO（二甲基亚砜）：日本纯正化学株式会社；RPMI 1640培养液、FBS、trypsin（胰蛋白酶）、EDTA、100 unit／mL青霉素-链霉素溶液：美国Gibco公司。MCF-7人乳腺癌细胞：美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

1.2 仪器与设备

WPL-30恒温培养箱：江东精密仪器有限公司；UV-1750紫外分光光度计：日本岛津公司；MC096型二氧化碳培养箱：日本三洋电机株式会社；Elx800型酶标仪：美国Bio Tekinstruments公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水豆豉制作

根据文献［10］中水豆豉的制作方法，精选后的黄豆经蒸馏水（黄豆量的2倍）浸泡12 h，然后将其置于高压蒸气灭菌锅中，在105℃蒸煮60min。蒸煮后冷却至45℃，再将蒸煮黄豆后剩余的蒸豆水进行过滤，4℃冷藏保存至豆豉发酵结束。冷却后的黄豆置于40℃恒温培养箱中，分别自然发酵24、48和72 h，最后加入黄豆质量10%的蒸豆水于发酵后的黄豆中制成不含调味料的水豆豉。将发酵好的水豆豉进行冷冻干燥，再用乙醇提取3次后蒸干，将蒸干后的乙醇提取物用二甲基亚砜溶解后冷藏保存待用。

1.3.2 基本营养物质的含量测定

水分含量采用直接干燥法，在105℃的干燥箱中测定；粗蛋白质含量采用微量凯氏定氮法测定；粗脂肪含量采用索格利特萃取法测定；粗灰分含量采用直接灰化法测定；粗纤维含量采用AOAC法测定［11］。

1.3.3 pH和酸度的测定

水豆豉样品打碎后用10倍的蒸馏水稀释，然后用pH计测定其pH值。1 g打碎的水豆豉样品用20 mL蒸馏水稀释后用0.1 mol／L的NaOH滴定至pH 8.3，计算样品的酸度公式为：总酸度＝

1.3.4 总菌数测定

1 g打碎的水豆豉样品用无菌生理盐水稀释10倍，涂抹在平板计数琼脂（PCA）上，30℃培养48 h观察菌落数，采用平板计数法对总菌数（CFU／mL）进行数菌［12］。

1.3.5 氨基酸态氮、铵态氮含量和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）活性的测定

取2 g样品采用甲醛值法测定氨基酸态氮含量，将水豆豉粉碎后加10倍量水稀释后再过滤，吸取5.0 mL过滤液，置于100 mL容量瓶定容，吸取20 mL，置于200 mL烧杯中，加入60 mL水，用0.1 mol／L的NaOH滴定至pH 8.3。再加入10 mL甲醛溶液后用0.1 mol／L的NaOH继续滴定至pH 8.3，同时另做1份以20 mL蒸馏水代替样品溶剂，重复以上步骤得到空白试验滴定消耗NaOH的量，记录所消耗的NaOH量，按下式计算氨基酸态氮的量［2］。

氨基酸态氮含量／mg%＝［样品消耗NaOH量（mL）-空白试验消耗NaOH量（mL）］×NaOH浓度（mol／L）×0.014／水豆豉取样质量（g）×100

样品粉碎后用蒸馏水稀释5倍振荡提取后过滤得到的滤液用AM505-K试剂盒采用Indophenol比色法进行铵态氮含量的测定，过滤液按要求加入试剂盒试剂后放置20 min后用分光光度计在635 nm处测定吸光度，通过下式计算得到铵态氮含量［13］。

取10 g样品用5倍蒸馏水稀释后振荡，用离心机离心取上层澄清液，然后用158-K试剂盒采用aminolicylic acid法进行γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）活性的测定［14］按下式计算。

1.3.6 活性异黄酮含量的测定

分别将大豆黄素和金雀异黄素标准品用体积浓度为80%乙醇溶解，配制成质量浓度为0.002～0.020 g／L标准溶液。以 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×25 mm，5μm）；流动相：40%甲醇；流速为1.0 mL／min；检测器灵敏度为 0.02 AUFS；检测波长为260 nm；柱温为50℃；取标准溶液20μL注入六通阀中，测定峰面积。得到大豆黄素标准曲线回归方程Y＝148 338+1.70×108X（R2＝0.995 5）；金雀异黄素标准曲线回归方程Y＝-316 706+4.20×108X（R2＝0.995 5）。取不同时间发酵水豆豉样品2 g，粉碎后加10倍量水稀释后4 000 r／min离心得到上清液，在80℃烘箱中干燥。干燥物用200 mL体积浓度为80%的乙醇在80℃恒温水浴中回流提取2 h，回流提取2次。合并提取液，减压蒸干，用无水乙醇定容至10.00 mL作为待测液，将待测液测定后对照标准曲线得到含量值。

1.3.7 水豆豉的感官评价

对水豆豉的感官性质采用感官定量分析法，以9分评分制进行感官评价。30名经过感官评价的感官评价员分别对水豆豉样品的外观、黏性、气味、质感、甘甜味、苦涩味、风味、综合口感和总体评价进行评分。评分标准为：极不喜欢或极弱（1分），不喜欢或较弱（3分），可接受或中等（5分），喜欢或强烈（7分），极喜欢或极强烈（9分）［15］。

1.3.8 水豆豉提取物的体外癌细胞增殖抑制效果的测定

将MCF-7人乳腺癌复细胞苏后接种在含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，将癌细胞放置在37℃，5%的CO2培养箱中培养，每周更换培养液2～3次并传代培养1次。将含癌细胞培养液以每孔200μL接种于96孔培养板，培养液的癌细胞浓度为1×104个／mL。然后将96孔培养板放入培养箱中继续培养24 h。吸出96孔板中各孔的培养液，加入水豆豉乙醇提取物的培养液200μL。48 h培养后，再次吸出各孔内上清液，各孔再加入200μL浓度5 mg／mL的MTT试剂后继续培养4 h后吸出各孔内的上清液，在每孔中加入200μL的DMSO后避光振荡30 min，用酶标仪在540 nm波长下测定各孔OD值，按下式计算：

1.3.9 RT-PCR分析

同等条件下用RNAzol试剂制备MCF-7人乳腺癌细胞总RNA。定量分离到RNA后，以oligo dT为引物，在AMV逆转录酶作用下制备ss cDNA，然后以该cDNA为模板，RT-PCR法扩增 Bax，Bcl-2，caspase-3，9基因（表1）。持家基因 glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作为内参照。试验结束后，以1%琼脂电泳（含浓度溴化乙锭）检查PCR扩增产物［17］。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 数据统计

使用SAS统计软件采用one-way ANOVA法对数据进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同发酵时间水豆豉的一般成分比较

由表2可知，48 h发酵的水豆豉在粗蛋白质含量上高于24和60 h发酵的水豆豉；48 h发酵的水豆豉的粗脂肪和灰分含量低于24和60 h发酵的水豆豉；水豆豉的水分含量和粗纤维含量随着发酵时间的增加而减小。

表2 不同发酵时间水豆豉的成分对比／%

2.2 不同发酵时间水豆豉的pH、酸度和总菌数

从表3可以看出，水豆豉的pH值和总菌数随着发酵时间的增加而减小，发酵时间为48 h的水豆豉的酸度值略高于24 h发酵水豆豉，低于60 h发酵水豆豉。

表3 不同发酵时间水豆豉的pH、酸度和总菌数

2.3 不同发酵时间水豆豉的氨基酸态氮、铵态氮和γ-GTP的含量

随着发酵时间的增加，水豆豉的氨基酸态氮和铵态氮含量明显增加，特别是在发酵初期，表现的最为明显，48 h发酵后的氨基酸态氮和铵态氮含量均约为24 h发酵水豆豉的3倍。48 h发酵的水豆豉含有最高含量的γ-GTP，60 h发酵的水豆豉的 γ-GTP含量略高于24 h发酵的水豆豉（图1）。

图1 不同发酵时间水豆豉的氨基酸态氮、铵态氮含量和γ-GTP含量

2.4 不同发酵时间水豆豉的大豆异黄酮含量

样品处理后，在色谱条件下测定，对照标准曲线从回归方程中求得样品的浓度并换算出样品中大豆黄素和金雀异黄素的含量。由图2可知，48 h发酵的水豆豉中大豆黄素和金雀异黄素的含量均高于24和60 h发酵水豆豉，随着发酵时间的进行，当发酵到48 h前，活性大豆异黄酮的含量迅速增加，然后其含量随发酵的进行略微下降。

图2 不同发酵时间水豆豉的活性大豆异黄酮含量

2.5 不同发酵时间水豆豉的感官评价

由图3可知，通过感官评价员的感官评价，观察到48 h发酵的水豆豉在外观、气味、质感、风味、综合口感和总体评价上都表现出最好的嗜好度，得到最高的评分。在黏性评分上，随着发酵时间的增加，黏性的评分越高，在甘甜味评分上48 h发酵的水豆豉表现出比24和60 h发酵水豆豉更高的强度，在苦涩度比较上，24 h发酵的水豆豉表现出很强的苦涩度，48和60 h发酵后苦涩度均明显降低。感官评价得到的结果与理化测定得到的结果相对应，48 h发酵的水豆豉在包括香味物质氨基酸态氮、铵态氮和γ-谷氨酰转肽酶的含量上高于24和60 h发酵水豆豉，其在气味、风味，综合口感上都优于另外的水豆豉。

图3 不同发酵时间水豆豉的感官评价

2.6 不同发酵时间水豆豉对癌细胞体外增殖抑制效果的比较

采用MTT法，检测水豆豉对MCF-7人乳腺癌细胞的体外抑制增殖效果。由表4可知，不同发酵时间水豆豉提取物处理癌细胞后的OD值读数发生明显变化，48 h发酵水豆豉的OD值低于24和60 h发酵水豆豉，通过计算可以得出48 h发酵水豆豉对MCF-7癌细胞具有最强的生长抑制效果。

表4 不同发酵时间水豆豉对MCF-7人乳腺细胞的体外增殖抑制效果

2.7 不同发酵时间水豆豉对癌细胞Bax、Bcl-2、caspases基因的mRNA表达影响

用水豆豉提取物处理MCF-7人乳腺癌细胞，发现，48 h发酵水豆豉处理过的 MCF-7癌细胞的Bax、caspase-3和caspase-9表达最强，60 h发酵水豆豉处理过的癌细胞的Bax、caspase-3和caspase-9表达强于24 h发酵水豆豉；Bal-2的mRNA表达则表现出相反的趋势（图4），并且经过定量分析后可以看出各组之间具有显著的差异性（P＜0.05）。

图4 不同发酵时间水豆豉对MCF-7人乳腺癌细胞的Bax、Bcl-2和caspasesmRNA表达的影响

3 讨论

发酵时间是影响发酵产品品质的一个重要方面，对发酵产品的成分、风味和功能性作用等都有很大的影响，特别是对水豆豉的滋味有较大的影响。氨基酸态氮有利于食品产生鲜味［18］，铵态氮是一种带有刺激性气味的物质［19］，从试验结果来看，水豆豉随着发酵时间的增加，其氨基酸态氮和铵态氮含量都明显升高，60 h发酵的水豆豉两者含量最高，氨基酸态氮较48 h发酵水豆豉增幅幅度不大，但是铵态氮增幅较大，所以虽然其鲜味比48 h发酵水豆豉好，但同时其刺激味却大幅度增加。γ-GTP是一种能产生香味成分的酶［20］，48 h发酵水豆豉的γ-GTP含量高于其他发酵时间水豆豉。通过测定3种主要的香味物质，发现48 h发酵水豆豉具有最好的香气组成。结合感官分析结果，48 h发酵的水豆豉在各项评价指标中均表现出最好的嗜好度，香味和甘甜度，发酵也降低了苦涩味，在整体的感官评价上优于其他发酵时间的水豆豉。在对乳腺癌细胞的体外癌细胞抑制效果评价上，首先观察受试物对癌细胞体外增殖抑制效果，通过癌细胞增殖的情况可以从一定程度上判断受试物的抗癌功效［21］。相对于其他发酵时间的水豆豉，初步判断，48 h发酵水豆豉对癌细胞的生长抑制效果最好，具有更好的体外抗癌效果。Bcl-2基因是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可与促凋亡Bax形成二聚体，Bax相对量高于Bcl-2时，Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡［22］。Caspase基因选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡，caspase-9为凋亡途径的上游 caspase，caspase-3为下游 caspase，caspase-9作为启动性caspase，随着表达的加强可以加强对下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡［23］，Bax、caspase-3和caspase-9表达增强及Bcl-2表达减弱均能证明具有诱导癌细胞凋亡的癌细胞抑制功效。通过进一步的分子生物试验，观察到48 h发酵的水豆豉也表现出对癌细胞凋亡最强的诱导效果。大豆中含有的大豆异黄酮具有很好的抗癌效果，同时发酵后的大豆制品中部分大豆异黄酮可转化为更易发挥抗癌功效的大豆黄素和金雀异黄素这2种活性异黄酮物质［24］，能更好的起到对癌细胞的抑制作用。48 h发酵水豆豉中这2种活性大豆异黄酮含量最高，由此产生的体外癌细胞抑制功效也最强。

4 结论

在40℃下采用自然发酵时，48 h发酵的水豆豉具有最好的理化品质和对MCF-7人乳腺癌细胞体外抑制效果，但是发酵食品的生产是一个复杂的工艺，温度、时间、菌种和水分等都是影响发酵的重要因素，这些因素相互之间的影响会改变其他因素的状态，所以多因素结合确定最佳的功能性水豆豉的生产条件有待进一步的研究。

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Influences of Fermentation Period on Physicochemical Properties of Black Cured Beans and MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Vitro

Zhao Xin Qian Yu

（School of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067）

Black cured beans is a kind of short time-fermented soybean food.In this study，physicochemical and in vitro cancer cells experiments were used to evaluate the physicochemical properties and anticancer effects of different fermented time black cured beans.The pH，acidity，total viable count，amino acid nitrogen content，ammonium nitrogen content，activity ofγ-GTP，sensory evaluation，MTT and RT-PCR were determined.As the fermentation time increased，the pH and total viable count increased in black cured beans.Black cured beans fermented for 48 h exhibited the highest contentof crude protein，acidity，γ-GTP and activity of soybean isoflavones（daidzein and genistein）than others.The sensory evaluation of 48-hour-fermented black cured beans was better than those of black cured beans in other fermentation periods.The 48-hour-fermented black cured beans showed the best growth inhibitory effect in MCF-7 human breast cancer cells.The 48-hour-fermented black cured beans increased the Bax，caspase 3 and 9 genes of MCF-7 cells，and decreased the Bcl-2 gene compared with black cured bean in other fermentation periods.Therefore，the 48-hour-fermented black cured beans showed the best physicochemical quality and in vitro anticancer effects.The results provide the theoretical foundation formanufacturing technique of black cured beans.

black cured beans，physicochemical properties，fermentation period，MCF-7 human breast cancer cells，anticancer

TS218

A

1003-0174（2015）01-0027-06

重庆第二师范学院教改项目（JG20132206），重庆高校创新团队建设计划（KJTD201325）

2013-09-18

赵欣，男，1981年出生，教授，食品营养学

骞宇，女，1976年出生，讲师，食品营养学