鹰嘴豆降胆固醇肽的制备及活性

姚余祥 张久亮 何 慧 郝旭赞 侯 焘 王 驰

（华中农业大学食品科技学院 环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070）

鹰嘴豆降胆固醇肽的制备及活性

姚余祥 张久亮 何 慧 郝旭赞 侯 焘 王 驰

（华中农业大学食品科技学院 环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070）

为了获得降胆固醇肽，本试验以鹰嘴豆为原料，将提取的分离蛋白通过碱性蛋白酶水解，选择加酶量、料液比、酶解时间3个因素，以水解度和胆固醇抑制率为考察指标，进行单因素试验，并在此基础上，以胆固醇抑制率为评价指标，采用Box-Behnken响应面分析法优化酶解鹰嘴豆蛋白，制备降胆固醇活性肽的条件；并将制备的鹰嘴豆肽对Wister大鼠进行试验。结果表明：鹰嘴豆蛋白最佳酶解工艺为：pH 8.0，加酶量2%，料液比2%，酶解温度50℃，酶解时间80 min，在此条件下鹰嘴豆多肽体外胆固醇抑制率可达到71.55%；动物试验显示灌胃100 mg／kg bw剂量的鹰嘴豆肽可使大鼠体内胆固醇含量降低22.39%。

鹰嘴豆肽 响应面优化 降胆固醇 水解度 活性

鹰嘴豆（Chickpea Cicer arietinum L）是一年生或多年生草本植物，因其籽粒像鹰嘴而得名，鹰嘴豆主要分布在干旱贫瘠的地方，在我国主要分布在新疆、青海、甘肃等地。豆类中鹰嘴豆产量居世界第三，为世界第二大消费豆类［1］。鹰嘴豆作为植物蛋白质的重要来源，富含人体所需的18种氨基酸以及8种必需氨基酸，为全价蛋白。鹰嘴豆营养丰富，具有很好的食用及药用价值，具有抗骨质疏松［2］、抗氧化［3］、降低血糖、血脂和调节胆固醇水平［4-5］等药理活性，其调节胆固醇的活性因子被认为是鹰嘴豆皂苷，是新型的营养健康食品［6］。

鹰嘴豆肽是鹰嘴豆分离蛋白在一定条件下水解得到的，目前对鹰嘴豆肽的活性研究主要集中在其抗氧化［7］、抑制肿瘤作用、免疫调节［8］、血管紧张素转化酶（ACE）抑制［9］等方面。

胆固醇摄入量过多，会引起高胆固醇血症，使心脑血管疾病的发病率明显提升，进而形成冠状动脉粥样硬化性心脏病等所谓的“富贵病”，而心脑血管疾病是人类健康的第一杀手［10］。临床治疗表明，通过药物干预来降低血清胆固醇水平，可以有效预防和治疗心脑血管疾病，但有副作用［11］；而以食源性蛋白质酶法改性制得的生物活性肽安全无毒，易吸收。

众所周知大豆肽具有调节血脂和降低血液胆固醇的作用［12］。本试验旨在考察鹰嘴豆肽是否具有降低胆固醇的活性，以鹰嘴豆为原料，将提取的鹰嘴豆分离蛋白经过酶解，在单因素试验基础上，通过体外模拟胆汁胶束溶液，以水解度和胆固醇抑制率为考察指标，并采用Box-Behnken响应面分析法，确定了制备具有降低胆固醇活性的鹰嘴豆肽的最佳酶解工艺，并结合动物试验对其体内降胆固醇活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆：新疆阿克苏。

实验动物：体重160～180 g Wister大鼠，购于湖北省疾控中心（许可证号：SCXK（鄂）2008-0005）。

Alcalase碱性蛋白酶：诺维信生物技术有限公司；牛黄胆酸钠：上海源叶生物科技有限公司；其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器

LE-80K超速离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；PB-10 Sartorius标准型pH计：德国赛多利斯股份公司；LGJ-12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；生化分析仪：美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 脱脂鹰嘴豆粉的制备［13］

鹰嘴豆经粉碎机粉碎，过80目筛，石油醚脱脂。豆粉∶石油醚为 1∶10（w／V），室温连续搅拌 60 min，鹰嘴豆自然沉降与石油醚分离，倾出石油醚进行回收，重复上述提取工艺2次。最后鹰嘴豆粉置通风橱中室温下过夜，将处理好的脱脂粉袋装置-4℃冰箱保存。

1.3.2 鹰嘴豆分离蛋白的制备

采用碱溶酸沉淀法提取分离蛋白［13］。脱脂鹰嘴豆粉与水 1∶10（w／V）混合，用 0.5 mol／L NaOH调 pH 8.0搅拌 1 h，4 000 r／min离心 20 min，沉淀按固液比1∶5（w／V）提取 2次，将3次上清液合并，上清液用0.5 mol／L的HCl调至等电点pH 5.5沉淀蛋白，去离子水洗涤3次，将沉淀干燥即为鹰嘴豆分离蛋白，粉碎后过80目筛，测蛋白质含量。

1.3.3 鹰嘴豆酶解工艺

称取适量鹰嘴豆蛋白溶于蒸馏水中，置于酶解反应器中，混合均匀。80℃预热20 min，然后将混合液迅速调节到碱性蛋白酶的最适温度和最适pH范围内，缓慢搅拌的同时加入适量碱性蛋白酶，通过滴加0.5 mol／L的NaOH溶液来维持反应体系的pH不变，并按一定的反应时间间隔记录NaOH消耗量。根据pH-stat法计算水解度（DH）值。反应完毕后，将制得水解液放置于沸水中灭酶10 min，再放入冰浴中立即冷却，离心（4 500 r／min，10 min），将上清液冻干并储藏备用。

鹰嘴豆分离蛋白水解度（DH）测定与控制采用pH-stat法［14-16］。

式中：B为碱液体积／mL；Nb为碱液的浓度／mol／L；α为 α-氨基的解离度（10／11）；Mp为底物中蛋白质总量／g／kg；H tot为底物蛋白质中肽键总数（mmol／g／鹰嘴豆蛋白：H tot＝7.22）。

1.3.4 鹰嘴豆肽体外降胆固醇活性

胆固醇胶束溶解度抑制率的测定［17］。模拟胆汁胶束溶液包含：10 mmol／L牛磺胆酸钠，2 mmol／L胆固醇，5 mmol／L油酸，132 mmol／L NaCl，15 mmol／L磷酸钠缓冲液（pH 7.4），5 mg／mL鹰嘴豆肽粉末，超声波乳化，然后在37℃培养24 h，超速离心（23 700 r／min，60 min）后取上清液测定胆固醇含量，上清液中胆固醇浓度即为胆固醇胶束溶解度（mmol／L）。以不加肽的胶束浓度为空白，计算抑制率。

抑制率＝（空白溶液的胆固醇溶解度-样品溶液的胆固醇溶解度）／空白溶液的胆固醇溶解度×100%

1.3.5 鹰嘴豆酶解单因素试验

分别以温度、pH、加酶量、料液比、水解时间为单因素，以水解度和胆固醇的抑制率作为试验指标进行研究。

1.3.6 鹰嘴豆酶解工艺的响应面试验

在单因素试验的基础上，选取加酶量、液料比、提取时间为试验因素，以胆固醇抑制率为响应指标，设计Box-Behnken试验，利用Design-Expert7.1.4软件进行回归分析。

1.3.7 动物试验

Wister健康雄性大鼠20只，用基础饲料喂养适应一周，试验环境下，随机分为2组，每组10只，第1组为高脂模型组，第2组为受试组。1周后尾静脉取血，测定血清总胆固醇含量；然后两组均喂高脂饲料［18］4周，期间模型组灌胃生理盐水，受试组灌胃鹰嘴豆多肽，剂量为100 mg／kg bw，试验结束比较总胆固醇含量。试验期间各组大鼠自由饮水（自来水）和自由进食高脂饲料。试验动物房通风条件良好，温度（25±3）℃，相对湿度（RH）60%～70%。试验数据采用SAS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酶解pH的选择

固定酶解温度50℃，时间60 min，酶底比3%，料液比2%，改变pH条件测定酶解肽对胆固醇含量的影响，并计算水解度和胆固醇抑制率，结果如图1所示。

图1 酶解pH对水解度及鹰嘴豆肽胆固醇抑制率的影响

从图1中可以看出随着pH的升高，肽的胆固醇抑制率先增后减。当pH 8.0时，酶解得到的鹰嘴豆肽对胆固醇的抑制率最高，此时正值Alcalase的最适pH，且此酸度下鹰嘴豆分离蛋白易溶解，酶解效率高；pH过高时，蛋白酶酶解效率降低。同时由图1可以看出随着酶解pH的升高，水解度亦呈现先增后减的趋势，当pH为8时水解度达到最大，故宜选择pH 8.0为本试验的最适水解酸度。

2.1.2 酶解温度的选择

固定酶解pH 8.0，时间60 min，酶底比3%，料液比2%，改变温度条件，测定酶解肽对胆固醇含量的影响，并计算水解度和胆固醇抑制率，结果如图2所示。

图2 酶解温度对水解度及鹰嘴豆肽胆固醇抑制率的影响

从图2中可以看出随着温度的升高，胆固醇抑制率先升后降。随着温度的升高，越来越接近酶的最适温度，当达到50℃以后，继续升高温度胆固醇抑制率逐渐下降。同时由图2可以看出随着温度的升高，水解度亦呈现先增后降的趋势，这是因为Alcalase的最适温度下酶解效率高，继续升高温度酶解效率有所下降，故选择温度50℃为宜。

2.1.3 加酶量的选择

固定温度50℃，pH 8.0，料液比为1∶50，改变加酶量，酶解60 min，测定酶解肽对胆固醇含量的影响，并计算水解度和胆固醇抑制率，结果如图3所示。

图3 加酶量对水解度及鹰嘴豆肽胆固醇抑制率的影响

从图3可以看出，随着加酶量的增加，胆固醇抑制率不断的增加，当加酶量达到2%时，胆固醇抑制率达到最大，加酶量继续增加，抑制率反而有所下降。同时由图3可以看出随着加酶量的增加，水解度不断增加，当加酶量到达4%时，水解度达到了最大，此后有所下降；经统计学处理，加酶量为2%时的水解度与加酶量为4%时水解度无显著性差异，综合考虑选择适宜加酶量为2%。

2.1.4 料液比的选择

固定温度50℃，pH 8.0，加酶量为2%，改变料液比条件，酶解60 min，测定酶解肽对胆固醇含量的影响，并计算水解度和胆固醇抑制率，结果如图4所示。

图4 料液比对水解度及鹰嘴豆肽胆固醇抑制率的影响

由图4可以看出，随着料液比的增加，胆固醇抑制率呈现先增后减又增的趋势，同时由图4可以看出随着料液比的增加，水解度不断的下降，当加酶量到达4%时，水解度趋于一个稳定值。综合考虑选择适宜料液比为2%。

2.1.5 酶解时间的选择

固定温度50℃，pH 8.0，加酶量为2%，料液比为2%条件下，改变酶解时间，测定酶解肽对胆固醇含量的影响，并计算水解度和胆固醇抑制率，结果如图5所示。

图5 酶解时间对水解度及鹰嘴豆肽胆固醇抑制率的影响

由图5可以看出，随着水解时间的增加，鹰嘴豆肽的胆固醇抑制率呈现先增后减的趋势，当水解时间为80 min时，其胆固醇的抑制率达到最大；同时随着水解时间的增加，水解度不断的上升，当水解时间到达120 min时，水解度达到最大。由此可见，鹰嘴豆肽的胆固醇抑制活性与水解度并非完全正相关。本试验中宜选择水解时间为80min，此时的水解度为17.73%。

2.2 响应面优化设计试验

2.2.1 设计试验

根据单因素试验结果，选定酶解温度为50℃，pH 8.0条件下，以加酶量（X1）、料液比（X2）、酶解时间（X3）3个因素为变量因子，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低3个水平，根据Box-Behnken响应面三因素三水平设计方法研究3个变量对鹰嘴豆多肽降胆固醇活性的影响，设定的试验因素和水平见表1。

表1 响应面分析因素与水平

2.2.2 回归模型的建立及其显著性检验

对表2试验结果进行多元回归拟合，得胆固醇抑制率对加酶量（X1）、液料比（X2）和酶解时间（X3）的二次多项式回归模型为：

表2 碱性蛋白酶提取鹰嘴豆多肽的降胆固醇活性Box-Behnken试验设计结果

从表3可以看出，模型“P＞F”值小于0.01，表明该回归模型极显著（P＜0.01）；复相关系数R2＝0.9103，表明该模型与实际拟合较好；此外从方差分析结果可知为极显著因素，这表明加酶量，料液比以及酶解时间在制备降胆固醇肽中均起主要作用，并且对胆固醇抑制率的影响顺序为：酶解时间＞加酶量＞料液比。X1X2、X2X3、X1X3项均不显著，表明3个因素之间交互作用较小。

表3 自变量与应变量之间关系的回归模型评估

2.2.3 碱性蛋白酶提取鹰嘴豆多肽的响应面分析及优化

多元回归方程的响应面及其等高线图见图6～图8。通过该图可对任何两个交互影响碱性蛋白酶制备鹰嘴豆多肽的因素进行分析与评价，并从中确定最佳因素水平范围。

从图6～图8中可以看出方程存在极大值，即响应面的最高点，利用 Design-Expert7.1.4软件进行最优化分析，分析结果表明：酶解温度50℃、pH 8.0、酶解时间80.14min、料液比1.92%、酶底比1.86%，在该最佳条件下的胆固醇抑制率预测值为71.97%。为了验证响应面的可行性，采用酶解温度、pH、加酶量、料液比、酶解时间分别为50℃、8.0、2%、2%、80min时，胆固醇抑制率为71.55%，与预测值的相对误差仅为0.58%。

图6 加酶量和料液比对胆固醇抑制率影响的响应面和等高线图

图8 料液比和酶解时间对胆固醇抑制率影响的响应面

2.3 动物试验

由表4可知，经动物试验表明：受试组总胆固醇含量显著低于高脂模型组，其胆固醇含量降低了22.39%，这说明鹰嘴豆肽不仅在体外试验中有降低胆固醇的作用，同时动物试验也表明鹰嘴豆肽能有效抑制对膳食中胆固醇的吸收，降低血清胆固醇浓度。

表4 四周后各组大鼠血清胆固醇测定值

3 讨论

本试验在最佳条件下制得的鹰嘴豆肽其胆固醇抑制率高达71.55%，此值显著优于大豆肽的降胆固醇活性（用Alcalase酶水解大豆分离蛋白，水解度为18%的酶解物其降胆固醇活性最高，其对胆固醇胶束溶解度的抑制率为48.39%［19］）。本研究还发现鹰嘴豆肽的抑制胆固醇活性与水解度并非完全的成正相关关系，过度追求高水解度，会带来活性的损失。

由于膳食中的胆固醇在人体肠道中，和其他脂类一起，借助于胆盐的乳化作用，形成混合的胶束溶液，以胶粒形式存在的胆固醇才能被输送入肠黏膜细胞，再经淋巴系统进入血液循环。实验室条件下则是利用超声波乳化、超速离心的手段制备出一种人造胆汁胶束溶液，在体外模拟人体的肠道环境［20］。有报道大豆肽对胆固醇的抑制作用可能是由于大豆肽更容易与胆盐结合形成复合物，从而阻碍了微胶粒的形成，使胆固醇的吸收率降低［20］。鹰嘴豆肽与胆盐的结合能力或许比大豆肽更强，因为前者的体外试验数据为胆固醇抑制率71.55%，后者的体外试验数据为胆固醇抑制率48.39%，但其作用机理有待进一步研究。

大豆肽降胆固醇活性与肽段疏水性的大小有关系，随着疏水性的增加大豆肽降胆固醇的活性也增加，有报道经用75%的乙醇对大孔吸附树脂吸附的大豆肽洗脱后收集的组分，其对胆固醇的抑制率会明显增加［20］，这提示其降胆固醇作用强或许与此性质有关。

4 结论

本试验通过碱性蛋白酶酶解鹰嘴豆分离蛋白获得具有降胆固醇活性的多肽，采用响应面法对水解条件进行优化，以体外胆固醇抑制率为测定指标。试验结果显示最佳条件为：酶解温度50℃、pH 8.0、加酶量为2%、料液比为2%、酶解时间为80 min，在此条件下鹰嘴豆多肽体外胆固醇抑制率可达到71.55%；动物试验显示灌胃100 mg／kg bw剂量的鹰嘴豆肽可使大鼠体内胆固醇含量降低22.39%。

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Preparation and Bioactivity of Chickpea Hypocholesterolemic Peptides

Yao Yuxiang Zhang Jiuliang He Hui Hao Xuzan Hou Tao Wang Chi
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University Key Laboratory of Environment Correlative Dietology，Ministry of Education，Wuhan 430070）

To preparation the cholesterol-lowering peptides，isolated chickpea protein has been hydrolyzed by Alcalase.The amount of enzyme，thematerial to solvent ratio and enzymolysis time were the three test factories.By single factor and Box-Behnken response surfacemethodology，hydrolysis condition model has been established with inhibition rate of cholesterol as the evaluating index.Wistar ratswere used in the test for the prepared Chickpea.The optimum conditionswere：pH 8.0，the amountof enzyme 2%，material to solvent ratio 2%，enzymolysis temperature 50℃，enzymolysis time 80 min.On these conditions，the inhibiting rate of cholesterol of chickpea peptides is 71.55%in vitro.The concentration of cholesterol could be decreased by 22.39%with chickpea peptides（100 mg／kg bw）in vivo.

chickpea peptides，response surface optimization，cholesterol-lowering，degree of hydrolysis，Bioactivity

TS816.42

A

1003-0174（2015）01-0033-06

2013-11-07

姚余祥，男，1988年出生，硕士，农产品加工及贮藏工程

何慧，女，1960年出生，博士，教授，食品化学